فصلنامه بیماریهای گیاهی
سال پنجاهم شماره 3 (پاییز 1393)

طی بازدید های به عمل آمده از گلخانه و مزارع کشت شده گیاه دارویی آویشن دناییدر استان لرستان علائمی از قبیل بوته میری، مرگ گیاهچه،پژمردگی و پوسیدگیدرناحیهطوقه وریشه دیده شد. نمونه های دارای علائم بیماری جمع آوری و پس از شستشو و ضدعفونی، در محیط PDAکشت شدند. از نمونه های بیمار شش جدایه قارچی جداسازی شد که بر اساس اصول کخ، جدایهKa2 قادر به ایجاد پوسیدگی طوقه و ریشه گیاهچه های آویشن در شرایط آزمایشگاه و گلخانه و در نهایت مرگ گیاهچه شد. نتایج به دست آمده از ویژگی های ریخت شناسی بیمارگر رشد یافته روی محیط کشت نشان داد که جدایه بیمارگر با قارچ Rhizoctonia solani Kuehnمطابقت داشته و براساس جفت شدنبا جدایه هایمرجع آناستوموزی،به گروه آناستوموزی AG 2-2تعلق دارد. در نهایت با تعیین توالی ناحیه ITS جدایه مذکور و ترسیم درخت فیلوژنتیکی با توالی ITS جدایه های مشابه موجود در بانک ژن، مطابقت این بیمارگر به R. solani (AG 2-2) تایید شد. این بیمارگر برای اولین بار می باشد که از گیاه آویشن دنایی در ایران گزارش می شود.

ویروئیدها به عنوان کوچک ترین عوامل بیمارگر گیاهی متشکل از آر ان ا حلقوی تک لا بوده و بدون داشتن ژنوم رمزگذار، قادرند در میزبان گیاهی خود تکثیر شوند. به رغم مطالعات زیاد، هنوز تصویر روشنی از سازوکار بیماری زایی ویروئیدها به دست نیامده است. در مطالعه حاضر، پروفیل متابولیکی گوجه فرنگی رقم راتگرز آلوده به واریانت ملایم ویروئید غده دوکی سیب زمینی (PSTVd) مشخص و با گیاه مایه زنی شده با بافر مقایسه شده است. بدین منظور سه برگچه انتهایی برگ سوم گیاهان گوجه فرنگی به صورت مکانیکی با سی دی ان ای ویروئید غده دوکی سیب زمینی مایه زنی شد و 19 روز بعد، نمونه برداری از برگ هشتم این گیاهان به انجام رسید. متابولیت ها استخراج و به کمک دستگاه GC/MS شناسایی و اندازه گیری شده و مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. نتایج نشان دادند که در سطح آماری P ≤0.2، تعداد 40 متابولیت نسبت به شاهد خود تغییرات معنی داری نشان دادند که نتیجه تغییرات در چهارده مسیر متابولیکی در سلول های گیاه بود. مسیرهای تغییر یافته در برگ های گوجه فرنگی آلوده به PSTVd شامل این موارد بودند: پنج مسیر مرتبط با ساخت موم و کوتین، چهار مسیر تولید ترکیبات دفاعی، سه مسیر ساخت هورمون، یک مسیر تولید انرژی و یک مسیر تخریب کلروفیل. با توجه به پیچیدگی پاسخ های گیاه به آلودگی به ویروئید، با استفاده از رویکرد متابولومیکس، برهمکنش ویروئید- میزبان بررسی و تغییرات در سطح مسیرهای بیوشیمیایی گیاه مورد بحث قرار گرفته است.

به منظور شناسایی و تعیین پراکنش نماتودها در مزارع نخود، عدس، لوبیا و باقلا استان لرستان، طی سال های 1389 و 1390 تعداد 150 نمونه خاک و ریشه از مزارع شهرستان های مختلف استان جمع آوری شد. پس از استخراج، کشتن، تثبیت و انتقال نماتودها به گلیسرین، اسلایدهای میکروسکوپی دائمی تهیه شد. شناسایی گونه ها با استفاده از میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین دیجیتال و بر اساس ویژگی های ریخت شناختی و ریخت سنجی و با استفاده از کلیدهای معتبر انجام گرفت. در این بررسی 19 گونه نماتود از فوق بالاخانواده Tylenchomorpha (راسته Tylenchida) شناسایی گردید. در بین گونه های شناسایی شده، Aphelenchoides cyrtus، Ditylenchus medicaginis، D. parvus، Merlinius brevidens و Paratylenchus coronatusبه ترتیب 6/37، 8/30، 6/24، 5/20 و 1/19 درصد، بیشترین فراوانی را در مزارع مختلف حبوبات استان داشتند. بیشترین تعداد گونه به ترتیب از شهرستان های الشتر (19 گونه)، خرم آباد (15 گونه)، بروجرد (14 گونه)، دورود (13 گونه)، نورآباد (12 گونه)، کوهدشت (11 گونه)، ازنا و الیگودرز (10 گونه) و پلدختر (8 گونه) جداسازی شد. دو گونهAmplimerlinius paraglobigerusوHelicotylenchus scoticusبرای اولین بار از ایران گزارش و توصیف و شرح کاملی از گونه های Ditylenchus medicaginis و D. parvus ارائه شده است.

بیماری هوانگ لونگ بینگ (HLB) یا میوه سبز مرکبات یکی از بیماری های خطرناک مرکبات در دنیا است که اخیرا از ایران نیز گزارش شده است. برای انجام مدیریت بهینه بیماری HLB، ردیابی به موقع و سریع بیماری در باغ های مرکبات امری اجتناب ناپذیر است. به منظور مقایسه کارآیی روش های پی سی آر معمولی، nested-PCR، real-time PCR و تکثیر هم دمای وابسته به حلقه (Loop-mediated Isothermal Amplification) در ردیابی Candidatus Liberibacter asiaticus، عامل بیماری HLB در ایران، از نمونه های برگ مربوط به یک درخت پرتقال آلوده و یک درخت سالم استخراج دی ان ای کل انجام شد. سپس در مقادیر مختلف دی ان ای کل (از 100 نانوگرم تا 1/0 فمتوگرم) از گیاه آلوده و سالم ردیابی عامل بیماری با آزمون پی سی آر معمولی (با چهار آغازگر مختلف)، nested-PCR (با سه مجموعه آغازگر مختلف)، real-time PCR (با یک جفت آغازگر) و LAMP (با دو مجموعه آغازگر مختلف) انجام و حساسیت، اختصاصیت و صحت برای هر روش بررسی شد. کلیه روش ها، به جز پی سی آر معمولی با آغازگر F1/R1 (90 درصد)، در مقادیر 100، 10 و 1 نانوگرم از دی ان ای کل با حساسیت 100 درصد عامل بیماری را ردیابی کردند. روش پی سی آر معمولی (با هر کدام از چهار آغازگر) با مقدار 100 پیکوگرم DNA، به طور میانگین عامل بیماری را در حدود 30 درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر 1 پیکوگرم تا 1/0 فمتوگرم نتوانست عامل بیماری را ردیابی نماید. روش LAMP تا میزان 10 پیکوگرم از دی ان ای کل را با حساسیت 20 تا 30 درصد ردیابی نمود ولی در مقادیر پایین تر از این مقدار (1 پیکوگرم و کمتر از DNA)، با هرکدام از دو مجموعه آغازگر قادر به ردیابی عامل بیماری نبود. حساسیت روش LAMP شبیه یا در برخی مقادیر DNA اندکی بیشتر از پی سی آر معمولی بوده ولی سریع تر و ارزان تر از آن است. روش nested-PCR (با هر سه جفت آغازگر برای دور دوم)، عامل بیماری را با حساسیت 100 درصد تا مقدار 1 پیکوگرم دی ان ای کل ردیابی کرده و در کمترین مقدار دی ان ای کل یعنی 1/0 فمتوگرم نیز با حساسیت حدود 30 درصد عامل بیماری را ردیابی نمود. روش real-time PCR تا 10 فمتوگرم DNA، عامل بیماری را با حساسیت 100 درصد و در مقادیر 1 و 1/0 فمتوگرم DNA، عامل بیماری را با حساسیت 90 درصد ردیابی نمود و بیشترین حساسیت را نشان داد؛ با وجود این، از عیوب این روش وقوع بیشتر نتایج مثبت کاذب نسبت به سایر روش ها می باشد. براساس نتایج به دست آمده به دلیل حساسیت بالای روش های real-time PCR و nested-PCR در ردیابی عامل بیماری HLB، استفاده از این روش ها در ردیابی درختان آلوده به ویژه در مناطقی که بیماری بتازگی وارد شده یا خطر آلودگی وجود دارد در کنار سایر روش های ردیابی پیشنهاد می شود. در بسیاری از شرایط استفاده از روش nested-PCR با توجه به کمتر بودن نتایج مثبت کاذب و ارزان تر بودن نسبت به روش real-time PCR می تواند انتخاب مناسب تری برای ردیابی بیماریHLB باشد.

بیماری بلاست برنج یکی از مهم ترین و مخرب ترین بیماری های برنج در ایران می باشد. قارچ اندوفیت Piriformospora indicaموجب تحریک مقاومت سیستمیک علیه عوامل بیماری زای گیاهی می شود. در این مطالعه میزان تغییر بیان برخی ژن های مهم دفاعی در گیاهان تیمارشده توسط قارچ میکوریز P. indicaو گیاهان بدون میکوریز در زمان های مختلف پس از آلودگی به بیماری بلاست برنج ناشی از Magnaporthe oryzae با استفاده از تکنیک Real-time qPCRمورد بررسی قرارگرفت. بررسی فنوتیپی برهم کنش گیاه برنج و قارچ عامل بیماری بلاست در حضور قارچ میکوریز نشان داد که گیاه حساسیت کمتری در برابر بیماری از خود بروز داده است. همچنین تجمع ترانوشت ژن های Pr1b، NPR1، LOXو WRKY85در گیاهان تیمار شده باقارچ میکوریز در مقایسه با گیاهان بدون میکوریز در اثر آلودگی به بیماری بلاست برنج افزایش قابل ملاحظه ای را نشان داد. نتایج حاکی از نقش فعال قارچ P. indica در حفاظت از گیاه برنج در مقابل بیماری بلاست در اثر افزایش بیان ژن های مذکور می باشد.

تنش خشکی یکی از عوامل اصلی کاهش رشد در گیاهان است و می تواند باعث افزایش شیوع بیماری های پوسیدگی ریشه در گیاهان گردد. در این تحقیق اثر تنش خشکی بر بیماری پوسیدگی ریشه دانهال های پسته ناشی ازFusarium solani در شرایط گلخانه ای مورد بررسی قرار گرفت. آزمایش در سه سطح رطوبتی(80 درصد ظرفیت مزرعه= D0، 50 درصد ظرفیت مزرعه= D1و 25 درصد ظرفیت مزرعه= D2) و سه سطح قارچ عامل بیماری (شاهد=F0 و دو جدایه فوزاریوم= F1 وF2) انجام شد. آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب یک طرح کاملا تصادفی با شش تکرار اجرا گردید. نتایج حاصل از اندازه گیری شاخص های رشد و درصد کلنیزاسیون ریشه دانهال های پسته توسط عامل بیماری نشان داد که اثرات اصلی ناشی از مایه زنی عامل بیماری و تنش خشکی بر کلیه پارامترهای اندازه گیری شده در سطح 1% معنی دار است. اثرات متقابل تنش خشکی با عامل بیماری بر کلیه صفات مورد بررسی به جز وزن خشک ریشه (معنی دار در سطح 5%) در سطح 1% معنی دار بودند. بر اساس نتایج به دست آمده تنش خشکی باعث تشدید آثار منفی ناشی از مایه زنی بیمارگر شد و با تشدید تنش خشکی تاثیر بیمارگر نیز افزایش یافت به طوری که جدایهF2 فوزاریوم و سطح رطوبتی 25 درصد، بیشترین تاثیر منفی را از این نظر داشتند. با افزایش تنش خشکی میزان کلنیزاسیون ریشه توسط جدایه های فوزاریوم و همچنین شدت بیماری زایی افزایش یافت. بنابراین این مطالعه نشان داد که تنش خشکی می تواند باعث افزایش آثار منفی F. solani روی دانهال های پسته شود.

قارچ Togninia minima (مرحله غیر جنسی: Phaeoacremonium aleophilum)، رایج ترین گونه Phaeoacremonium مرتبط با بیماری پتری و اسکای مو در دنیا به شمار می رود. این قارچ دارای سیستم آمیزشی هتروتالیک دو قطبی می باشد. برای تولید مثل جنسی وجود دو جدایه متفاوت از نظر تیپ آمیزشی ضروری می باشد. در تحقیق حاضر امکان القای مرحله جنسی جدایه های ایرانی این قارچ در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور در تابستان 1391 از تاکستان های مناطق مختلف استان آذربایجان شرقی که دارای علایم بیماری اسکا بودند، نمونه برداری شد. جدایه های Phaeoacremonium aleophilum به دست آمده بر اساس صفات ریخت شناختیو آغازگرهای اختصاصی از قبل طراحی شده، مورد شناسایی قرار گرفتند. به منظور القای تولید مثل جنسی، تعداد چهار جدایه با منشا جغرافیایی متفاوت دو به دو روی محیط کشت آب- آگار دارای ساقه های اتوکلاو شده مو GWA)) تلاقی داده شدند. پریتسیوم ها پس از سه الی چهار هفته نگهداری در دمای C ° 22 و نور سفید فلورسنت ظاهر گردیدند. مشخصات ریخت شناختی ساختارهای جنسی با مشخصات گونه T. minima مطابقت کامل نشان داد. دو جدایه با تیپ آمیزشی مخالف به عنوان جدایه های آزمایشگر انتخاب و تیپ آمیزشی 34 جدایه Pm. aleophilum از طریق تلاقی با جدایه های آزمایشگر تعیین شد. نتایج این بررسی نشان داد که تیپ های آمیزشی بین جدایه های مورد مطالعه از توزیع غیر یکنواخت (2:1) برخوردار می باشد. تحقیق حاضر اولین مطالعه در راستای بررسی امکان وقوع تولید مثل جنسی Pm. aleophilum در ایران است.

نماتودهای بیمارگر حشرات بهعنوان عوامل کنترل زیستی حشرات شناخته شده اند ولی در سال های اخیر تاثیر آنها بر روی نماتودهای بیمارگر گیاهی نیز مورد بررسی قرار گرفته است. در این تحقیق تاثیر لاروهای آلوده کننده گونه Steinernema feltiae به دو صورت زنده و مرده در غلطت های 5، 10، 25، 50 و 100 لارو در هر میلی لیتر، به طور جداگانه و در ظرف های 24 چاهکی علیه نماتود ریشه گرهی Meloidogyne javanica در غلطت های 50 تخم، 50 لارو و مخلوط 50 تخم و لارو به ازای هر چاهک، مورد مطالعه قرار گرفت. آزمایش در قالب طرح کرت های خردشده در زمان انجام و یادداشت برداری داده ها بعد از 48، 72، 96 و 120 ساعت صورت گرفت. آزمایش در دو نوبت تکرار گردید.نتایج نشان داد کهزنده یا مرده بودن لارو این نماتود بیمارگر حشرات از نظر تاثیر روی مرگ ومیر لاروهای سن دوم و تفریخ تخم نماتود ریشه گرهی تفاوت معنی داری دارند. ولی در تاثیر روی مرگ ومیر لاروهای سن دوم و تفریخ تخم در حالت مخلوط 50 تخم و لارو نماتود ریشه گرهی، تفاوت معنی داری مشاهده نگردید. لاروهای زنده و مرده به ترتیب باعث حدود 38 و 32 درصد مرگ ومیر لاروهای سن دوم نماتود ریشه گرهی شده و 33 و 37 درصد بازدارندگی از تفریخ تخم نشان دادند. در آزمایش مخلوط تخم و لارو سن دوم هم، لاروهای زنده و مرده نماتود بیمارگر حشرات به ترتیب موجب 31 و 33 درصد مرگ ومیر لاروهای سن دوم نماتود ریشه گرهی و 33 و 34 درصد ممانعت از تفریخ گردید. به طور کلی، میزان مرگ ومیر لاروهای سن دوم نماتود ریشه گرهی و تفریخ تخم متناسب با افزایش زمان در تیمارها به ترتیب افزایش و کاهش نشان داد.

طی زمستان 1391 روی میوه های گوجه فرنگی در بازارهای شهرستان زنجان، علائم پوسیدگی سیاه رنگ و زخم های چوب پنبه ای مشاهده شد. پس از کشت بافت های آلوده در محیط کشت سیب زمینی- دکستروز- آگار (PDA)، قارچی پیکنیدیوم دار جدا گردید و این جدایه به عنوان گونه ای از جنس Phoma شناسایی شد. شناسایی گونه بر اساس ویژگی های کلیدی جدایه قارچی در محیط کشت های جو- آگار (OA) و مالت- آگار(MEA) انجام گردید (Boerema et al.، 2004). مشخصات مورفولوژیکی و میکروسکوپی قارچ در سه محیط کشت در دمای ̊C 24 و تاریکی بدین شرح بود: در محیط کشت PDA پرگنه قارچ طی روزهای اول بی رنگ بوده به تدریج رنگ آن به خاکستری مایل به زیتونی تا سبز زیتونی مبدل شد. پیکنیدیوم ها به فراوانی داخل محیط کشت تشکیل شدند. تراوش های کرم رنگ پیکنیدیوسپورها بر سطح پرگنه قابل رویت بودند. سرعت رشد قارچ زیاد بوده و پس از گذشت یک هفته، قطر پرگنه به هشت سانتی متر رسید. در محیط کشت های OA و MEA هم سرعت رشد قارچ نسبتا زیاد بود و پس از گذشت یک هفته قطر پرگنه در آنها به هفت سانتی متر رسید. در محیط کشت OA تعداد زیادی یاخته متورم ریسه ای که در محل بند دارای فشردگی بودند، تشکیل شدند. استفاده از یک قطره محلول فوق اشباع سود سوزآور (NaOH، pH > 12) در حاشیه در حال رشد کشت چهار روزه قارچ در این محیط کشت، موجب بروز واکنش E+ و ظهور رنگ سبز مایل به آبی طی ده دقیقه گردیدکه پس از گذشت حدود یک ساعت، رنگ قرمز جایگزین آن شد. پیکنیدیوم ها کروی تا نیمه کروی یا نامنظم دارای سطحی صاف، انفرادی یا مجتمع تشکیل شدند و دارای یک یا دو دهانه (استیول) بودند. توده کنیدیومی کرم رنگ بوده، پیکنیدیوسپورها بیضوی، دوکی یا سوسیسی شکل، یک یا دو یاخته ای، به ندرت سه یاخته ای بودند. پیکنیدیوسپور های تک، دو و سه یاخته ای به ترتیب دارای طول و عرض 4-5/7× 2-5/2، 5/7-8/8×5/2-3 و5/12-5/13× 4- 5 میکرومتر بودند (شکل 1). ویژگی های ریخت شناسی جدایه مورد مطالعه منطبق بر خصوصیات ذکر شده برای Boeremia exigua(Desm.) Aveskamp، Gruyter & Verkley var. exigua (Syn. Phoma exigua var. exigua)بود (Boerema et al. 2004). بخشی از منطقه ژن ریبوزومی شامل ناحیه ITS1+5.8S+1TS2مربوط به جدایه مورد مطالعه، با استفاده از جفت آغازگرهای ITS1 و ITS4 تکثیر و توالی یابی شد و با توالی های موجود در NCBI مقایسه گردید. توالی ژن ریبوزومی Phoma exigua isolate EF-11 (شماره توالی ثبت شده در بانک ژنی: gb|GU395499.1|)، با تشابه 99 درصد، دارای بیشترین تشابه با توالی مورد مطالعه بود. آزمون بیماری زایی روی میوه سترون شده گوجه فرنگی، با ایجاد خراشی به عمق یک میلی متر و طول دو میلی متر روی میوه و قرار دادن دیسک میسلیومی جوان روی زخم انجام گرفت. دما و رطوبت شکل 1. پیکنیدیوم و توده اسپوری Boeremia exigua در محیط کشت PDA(Aو B)، یاخته های متورم ریسه ای در محیط کشت OA (C)، پیکنیدیوسپورهای به دست آمده از کشت قارچ در MEA، مقیاس: 5 میکرومتر (D).
Fig. 1. Pycnidium and spore mass of Boeremia exigua on PDA (A and B); hyphal swollen cells on OA (C); pycnidiospores obtained from the culture on MEA، Scale bar = 5μm (D).
نسبی آزمون، به ترتیب 25 درجه سلسیوس و 60 الی 70 درصد بود. پنج روز پس از مایه زنی علائم پوسیدگی، میسلیوم بی رنگ و پیکنیدیوم ها در بخش مایه زنی شده میوه ها ظاهر شدند.
چندگونه از جنس (Boeremia (Phomaاز گوجه فرنگی در جهان گزارش شده اند که در این میان B. lycopersici وB. destructiva دارای اهمیت بیشتری هستند، B. lycopersici موجب پوسیدگی میوه و ساقه گوجه فرنگی می شود در حالی که B. destructiva عامل پوسیدگی میوه و یا سوختگی شاخ و برگ گوجه فرنگی است (Boerema et al. 2004). گونه B. exigua نیز به عنوان یکی از عوامل لکه برگی و پوسیدگی میوه گوجه فرنگی گزارش شده، اما در مقایسه با B. lycopersiciو B. destructiva، تعداد گزارش های شیوع این گونه روی میوه گوجه فرنگی، کمتر است (Snowdon، 1991). B. exigua، واریته های مختلفی دارد که برخی واریته ها بیمارگر های مهم و اختصاصی گیاهان هستند.
B. exigua var. exigua به عنوان قارچی خاکزی، اغلب ساپروفیت و یا انگل ضعیف گیاهان با دامنه میزبانی وسیع شناخته می شود (Boerema et al. 2004). این اولین گزارش از وقوعاین قارچ روی گوجه فرنگی در ایران است. مرکز کشت میوه های آلوده در این تحقیق، شهرستان بوشهر در جنوب ایران بوده است.

طی دو سال زراعی 1391 و 1392 به منظور بررسی آلودگی درختان سیب به ویروس ساقه گودکی سیب (Apple stem pitting virus، ASPV) از نهالستان ها و باغ های واقع در استان های تهران، اصفهان، آذربایجان غربی، البرز، قزوین، همدان، مازندران، مرکزی، و لرستان نمونه برداری تصادفی انجام شد. مجموعه ای شامل 1053 نمونه جمع آوری شده با استفاده از آزمون سرولوژیکی الایزای مستقیم (DAS-ELISA) و کیت تجاری ASPV (بایوربا- سوئیس) مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج این تحقیق نشان داد 54 نمونه سیب (12/5%) به ASPV آلوده بودند. تمام نمونه های مثبت در واکنش الایزا متعلق به نمونه های برگی از درختان سیب گلاب (Gala apple)، دارای علائم بدشکلی و پیسک خفیف بودند (شکل 1). بیشترین شیوع ویروس ASPV در استان البرز (8/13%) مشاهده شد و بعد از آن استان های تهران (4/11%)، مرکزی (2/7%)، همدان (1/7%)،لرستان (7%)، قزوین (5/6%) و مازندران (8/4%) قرار داشتند در اصفهان و آذربایجان غربی نمونه مثبت مشاهده نشد. به منظور تایید شناسایی ویروس، آر ان ای کل از تعداد 54 نمونه برگی با استفاده از روش توصیف شده چانگ و همکاران (1993) استخراج شد و واکنش RT-PCR با استفاده از آغازگر های اختصاصی ویروس ASPV (رس شمار بانک ژن، D21828) جهت تکثیر بخشی از منطقه ژنی رمز کننده پروتئین پوششی ویروس انجام پذیرفت. آغازگر های پیش سو (ASPV sense)5 ́ATGTCTGGAACCTCATGCTGCAA 3 در موقعیت 8895-8869 و پس سو (ASPV antisense)5 ́TTGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATAA 3 در موقعیت 9238-9211 (Menzel et al. 2002)، دی ان ای ویروسی به اندازه 370 جفت باز شامل بخشی از ژن رمز کننده پروتئین پوششی ویروس را در نمونه های آلوده تکثیر نمودند (شکل 2). براساس اطلاعات موجود، گزارش حاضر اولین گزارش از وقوع این ویروس در ایران است.

پده (Populus euphratica Oliv.) به عنوان یکی از درختان بومی خاورمیانه، بخش مهمی از پوشش درختی مناطق بیابانی استان خوزستان را تشکیل می دهد. در پاییز سال 1391 علائم لکه برگی و سوختگی برگ در درختان پده حاشیه رودخانه کارون در بالادست شهر اهواز (شهرهای ویس و ملاثانی) دیده شد. لکه ها به رنگ قهوه ای تیره تا سیاه، گرد و یا بیضی شکل و بدون محدودیت به رگبرگ ها در هر دو روی برگ دیده شد(شکل 1). در برگ هایی که تعداد زیادی لکه تولید شده بود علائم سوختگی مشاهده و در ادامه باعث ریزش برگ ها می شد. بعد از ضدعفونی سطحی به وسیله هیپوکلریت سدیم 1%، قطعاتی از برگ های حاوی لکه ها بریده و روی محیط کشت سیب زمینی دکستروز آگار (PDA) کشت داده شد. بعد از 48 ساعت، مسیلیوم سفید رنگ قارچ اطراف قطعات گیاهی را فرا گرفت و با گذشت زمان، توده اسپورهای قهوه ای تیره روی مسیلیوم نمایان شد.از محیط های کشت سیب زمینی دکستروز آگار (PDA) و دیکلران - رزبنگال - عصاره مخمر- سوکروز- آگار (DRYES) به منظور مطالعه رنگ استاندارد پرگنه قارچ استفاده شد. همچنین سرعت رشد پرگنه قارچ در مدت سه روز و رنگ پرگنه بعد از هفت روز، هم در سطح رویی و هم در سطح پشتی تشتک پتری ارزیابی شد (Andersen and Thrane 1996). قارچ جدا شده از برگ های پده دارای پرگنه ای به رنگ قهوه ای تا زیتونی در روی محیط کشت و دیکتیوسپورهای قهوه ای کمرنگ تا زیتونی کمرنگ با ابعاد 35-18 و 18-10 میکرومتر با کنیدیوفورهای کوتاه، دیواره دار، قهوه ای تا سبز، منشعب یا غیر منشعب و به طول 5/5 (5/2 تا 5/7) میکرومتر بودند. کنیدیوم های قارچ انفرادی و یا در زنجیره های دو تا سه تایی مشاهده شده و به شکل تخم مرغی تا بیضی کشیده با دو تا چهار دیواره عرضی و یک تا دو دیواره طولی، بدون نوک (Beak) و با سطح صاف بودند. رشد قارچ در روی محیط PDA در دمای 25 درجه سلسیوس سریع بوده و در سه روز به 35 میلی متر رسید. بر اساس ویژگی های ریخت شناسی و خصوصیات پرگنه، قارچ جداسازی شده Alternaria alternata تشخیص داده شد (Lawrence et al 2013). آزمون بیماری زایی قارچ روی برگ های جوان پده انجام گرفت. سوسپانسون اسپورهای A. alternata با غلظت 105×1 اسپور در میلی لیتر در آب مقطر استریل تهیه شد. برگ های پده بلافاصله بعد از جدا شدن از درخت به همراه دمبرگ در درون تشتک های پتری 12 سانتی متری استریل قرار داده شده و برای حفظ حیات آنها، انتهای دمبرگ ها درون توده ای از پنبه استریل که توسط آب مقطر استریل اشباع شده بود قرار داده شد. قطرات سوسپانسیون اسپور A. alternata به میزان μl 15 در نقاط مختلف سطح برگ ها قرارداده شد. تشتک های پتری در دمای 2±25 درجه سلسیوس و دوره نوری 8/16 نگهداری شدند(شکل 2A). بعد از گذشت هفت روز از مایه زنی برگ ها، علائم لکه برگی، شبیه به علائم ایجاد شده در طبیعت در نقاط تلقیح شده برگ ها دیده شد (شکل 2B). قارچ A. alternata از برگ های مایه زنی شده دوباره جداسازی و خالص سازی شد. به منظور ارزیابی شکل 1. علائم بیماری لکه برگی پده ناشی از قارچ Alternaria alternata Fig. 1. Symptoms of the leaf spot disease caused by Alternaria alternata on poplar leaves شکل 2. آزمون بیماری زایی قارچ Alternaria alternata روی برگ پده. تلقیح برگ توسط سوسپانسیون اسپور A. alternata (A) و علائم بیماری هفت روز بعد از مایه زنی (B) Fig. 2. Pathogenicity test of Alternaria alternata on poplar leaf. Inoculation of the poplar leaf by the spore suspension of A. alternata (A). Leaf spot symptoms on the leaf، seven days after inoculation (B).
توانایی تولید توکسین های قارچی، کشت مایع A. alternata در محیط کشت عصاره مخمر- دکستروز تهیه شده و عصاره کشت (Culture filtrate) آن توسط میکروفیلتر 22/0 μm تهیه شد. آزمون بیماری زایی عصاره کشت قارچ روی برگ های سالم پده به روش اشاره شده در بالا انجام پذیرفت. علائم لکه برگی بعد از گذشت پنج روز در برگ های مایه زنی شده دیده شده و تولید توکسین قارچی توسط جدایه A. alternataثابت شد. با توجه به خصوصیات ریخت شناسی و بیماری زایی سوسپانسیون اسپور و عصاره کشت قارچ، عامل بیماری لکه برگی در درختان پده حاشیه رودخانه کارون قارچ A. alternata معرفی می شود. بر اساس منابع موجود، این اولین گزارش از بیماری زایی A. alternata در درخت پده در ایران است.