مجله فنآوری زیستی در کشاورزی
سال چهاردهم شماره 2 (زمستان 1394)

کشت سوسپانسیون سلولی، تعلیقی از سلول های در حال رشد و تقسیم سریع می باشد که در محیط مایع کشت می شوند. سلول ها در سوسپانسیون سلولی از قدرت تقسیم بسیار بالاتری نسبت به کالوس ها برخوردار می باشند. این قابلیت سلول ها برای اهداف متنوعی مانند تولید لاین های سلولی، تولید متابولیت های ثانویه، بررسی مراحل چرخه سلولی، افزایش راندمان انتقال ژن و مطالعات تنش های زیستی و غیرزیستی مورد استفاده قرار می گیرد. در این بررسی، کالوس از بذور نه رقم از توتون های شرقی (.Nicotiana tabacum L) در محیط MS حاوی هورمون های NAA mg.l-1 1 و Kinetin mg.l-1 1 تهیه گردید. سپس میزان و کیفیت رشد در محیط های مختلف مورد آزمون قرار گرفت. بهترین میزان و کیفیت رشد برای ارقام OR-209،OR-205 و PDB 328 در محیط کشت LS با تیمارهای هورمونی IAA mg.l-1 3، NAA mg.l-1 3 و Kinetin mg.l-1 1/0 به دست آمد. اثر انواع محیط های کشت و ترکیبات مختلف هورمونی بر روی سوسپانسیون سلولی حاصل نیز آزمون گردید. بهترین رشد مربوط به رقم OR-209 در محیط کشت LS مایع با همان تیمار هورمونی بود. در آخر، سوسپانسیون سلولی تولید شده از نظر سرعت رشد با لاین سلولی TBY-2 مقایسه گردید که مشابهت بسیار بالایی نشان داد. این نتیجه بیانگر امیدبخش بودن ارقام توتون شرقی برای تولید لاین های سلولی و بهره برداری از آن ها برای اهداف پژوهشی و کاربردی می باشد.

گزارش های متعددی از مقایسه کارآیی نشانگرهای مولکولی برای برآورد پارامترهای ژنتیکی گیاهان در مطالعات تنوع ژنتیکی منتشر شده است. اغلب تحقیقات بر روی ژنوم های گیاهی مختلف و برنامه های اصلاحی گوناگونی انجام گرفته است، ولی در این میان گزارشی مبنی بر مقایسه کارآیی نشانگرهای SSR و RAPD در برنامه های گزینش به کمک نشانگر (MAS) در ژنوم برنج مشاهده نشده است. به همین منظور، در این تحقیق کارآیی دو سیستم نشانگری فوق جهت تخمین برخی پارامترهای ژنتیکی در لاین های تلاقی برگشتی پیشرفته در برنج مورد مقایسه قرار گرفت. از 100 جفت آغازگر SSR و20 آغازگر RAPD برای انگشت نگاری ژنوتیپ ها استفاده شد. چندشکلی نشانگرهای RAPD بیشتر از نشانگرهای SSR، اما میزان اطلاعات چندشکلی نشانگر SSR بیش از دو برابر نشانگر RAPD به دست آمد. همبستگی ضعیفی میان دو سیستم مختلف نشانگری برای تخمین شباهت ژنتیکی نتاج به والد تکراری مشاهده گردید. همچنین نتایج نشان داد که افزایش تعداد نشانگر RAPD تاثیری در افزایش دقت برآوردها نداشت. با توجه نتایج این تحقیق پیشنهاد می شود که از نشانگر SSR در برنامه های گزینش استفاده شود.

بیماری پژمردگی باکتریایی ناشی از Ralstonia solanacearum از بیماری های مهم سیب زمینی در استان همدان است. برای بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های R. solanacearum نمونه های گیاهی مشکوک به آلودگی در بهار و تابستان سال 1389 از مناطق مختلف این استان جمع آوری گردید. کشت اندام های آلوده گیاهی (غده و ساقه) روی محیط نوترینت آگار (NA) حاوی تری فنیل تترازولیوم کلراید و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی، منجر به شناسایی 52 استرین R. solanacearum بیوار A2 گردید. برای تشخیص دقیق تر جدایه ها واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای ps96H و ps96I انجام شد. نتایج PCR نشان داد که نمونه ها همراه با نمونه استاندارد یک باند مشابه 148جفت بازی تولید نمودند. تنوع ژنتیکی 26 جدایه انتخابی با آغازگرهای BOX و ERIC مورد بررسی قرار گرفت. طول قطعات تکثیری با استفاده از آغازگر BOX A1R در محدوده 100 تا bp1500 و آغازگر ERIC از200 تا bp1200 متغیر بود. گروه بندی جدایه های به دست آمده با روش UPGMA و براساس ضریب جاکارد با استفاده از داده های هر دو آغازگر، جدایه ها را در سطح تشابه 74 درصد به 5 گروه اصلی منتسب کرد. نتایج حاصل نشان دهنده ی آن است که استرین های R. solanacearum جمع آوری شده خصوصیات فنوتیپی و ژنتیکی متفاوتی داشتند، هرچند ارتباط مشخصی بین منطقه جغرافیایی و خصوصیات استرین ها به دست نیامد. این بررسی کارآیی روشPCR با آغازگرهایBOX و ERIC را برای نشان دادن چندشکلی ژنتیکی در جمعیت های R. solanacearum نشان داد.

بیماری ویروسی پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی از مهم ترین بیماری های ویروسی گوجه فرنگی (Solanum lycopersicum L.) در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری و گلخانه های مناطق معتدل جهان به شمار می رود. به منظور تولید آنتی بادی علیه ویروس عامل بیماری برای استفاده در ردیابی و معرفی کیت تشخیص بیماری، پروتئین حرکتی همسانه سازی شده ویروس در ناقل بیانی pET26(b)+، از سویه BL21(DE3) باکتری Escherichia coli بیان شد و پروتئین نوترکیب استخراج و به خرگوش تزریق شد. آنتی سرم تهیه شده، به منظور بررسی کارآیی در ردیابی پروتئین بیان شده در باکتری و تشخیص ویروس در گیاهان آلوده، در آزمون های وسترن بلات و الایزا مورد استفاده قرار گرفت. در آزمون وسترن بلات و رقت 1 به 1500 آنتی سرم، باند 13 کیلودالتونی مربوط به پروتئین حرکتی ویروس را در گیاهان آلوده ردیابی کرد. در آزمون الایزا و رقت 1 به 1000 آنتی سرم، واسرشته کردن پروتئین سبب افزایش جذب نوری در نمونه های گیاهان آلوده شد هرچند این اختلاف از نظر آماری معنی دار نبود. این نتایج نشان داد که آنتی سرم تولید شده علیه پروتئین حرکتی ویروس پیچیدگی زرد برگ گوجه فرنگی برای آزمون وسترن بلات مناسب بوده و جهت استفاده در آزمون الایزا نیاز به تخلیص آنتی بادی دارد.

خانواده ی ژنی WRKY رمزکننده گروه بزرگی از عوامل رونویسی هستند که در تنظیم ژن های پاسخ دهنده به تنش های زیستی و غیرزیستی به خصوص در تنش خشکی دخیل می باشند؛ برای شناسایی اعضاء این خانواده ژنی در گندم، جستجوی چندگانه در پایگاه های اطلاعاتی مرتبط و tblastn براساس توالی های حفظ شده ی این خانواده در برنج در داده های nr، EST، HTGS انجام شد. توالی هایی مثل EST و cDNA (فاقد پروتئین) توسط نرم افزارهای DNAstar و NCBI ORF finder ترجمه شدند. هم ردیفی و آنالیز فیلوژنتیکی با استفاده از نرم افزارهای MEGA4 و BioEdit انجام گردید. الگوی بیانی این خانواده ی ژنی با استفاده از داده های ریزآرایه و در پایگاه های PLEXdb، GENEVESTGATOR بررسی شد. براساس نتایج به دست آمده، 94 عضو از خانواده ی ژنی WRKY در گندم یافت شد. برای 76 عضو پیدا شده ساختار حفظ شده خانواده WRKY به طور کامل وجود داشت و برای دیگر اعضاء توالی کامل پروتئین پیدا نشد. عوامل رونویسی WRKY در گندم همانند برنج بر مبنای ساختار دمین حفاظت شده WRKY به سه گروه تقسیم شدند. 7 عضو از این خانواده، با توجه به بیان افتراقی آن ها در پاسخ به تنش خشکی در ارقام حساس و متحمل گندم، به عنوان ژن های منتخب برای افزایش تحمل به خشکی در گندم انتخاب شدند.

ژن مایوستاتین متعلق به خانواده فاکتورهای تمایز رشد (TGF-β) می باشد که در رشد و نمو و بلوغ و به طور اختصاصی در توسعه ماهیچه اسکلتی بالغ بیان می شود. در این پژوهش با بهره گیری از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی، توالی اسیدآمینه ای پروتئین مایوستاتین در گونه های مختلف ازجمله گاو، گوسفند، بز، اسب، خوک، مرغ، بوقلمون، اردک، غاز، کبوتر، موش و انسان بررسی شد. در هم ردیفی بخش پایانی پروتئین مایوستاتین (فرم فعال پروتئین مایوستاتین که به صورت دایمر بیان می شود)، درجه بالایی از حفاظت شدگی مشاهده شد، به طوری که نوسان تغییرات در این بخش نسبت به سایر قسمت های توالی پروتئینی، کمترین مقدار ممکن بود. با استفاده از سایت های تخصصی Proteus و Phyre2 ساختارهای ثانویه ای از قبیل مارپیچ آلفا، صفحات بتا و ساختار سه بعدی پروتئین مایوستاتین مورد بررسی قرار گرفت. اسیدآمینه های لوسین، لیزین، ایزولوسین و گلوتامیک اسید در گاو و گوسفند و بز فراوانی یکسانی را نشان دادند اما در مقایسه با ماکیان مانند مرغ، فراوانی بیشتری داشتند. حال آن که فراوانی این اسیدآمینه ها در توالی پروتئینی مایوستاتین انسان و خوک متوسط بود. بررسی درخت فیلوژنی نشان داد که تفاوت در توالی اسیدآمینه ای مایوستاتین در بین گونه های یاد شده باعث قرار گرفتن پرندگان در گروهی جدا شده از پستانداران شده است. بررسی ساختار سه بعدی نشان داد که ژن مایوستاتین دارای حفاظت شدگی بالایی در گونه ها است.

رتروترنسپوزون ها عناصر رایج در ژنوم گیاهان می باشند که فراوانی، فعالیت و توزیع یکنواخت آنها در ژنوم، استفاده از آنها را به عنوان نشانگرهای مولکولی ایده آل می سازد. به منظور مطالعه فعالیت، الگوی توزیع و چندشکلی ادغامی برخی رتروترنسپوزون های LTR (Long terminal repeat) در گیاه Linum austriacum L. از نشانگرهای IRAP (Inter-retrotransposon amplified polymorphism) و REMAP (Retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism) استفاده شد. نتایج نشان داد که رتروترنسپوزون های LTR مورد استفاده به لحاظ انتقالی در ژنوم L. austriacum فعال بوده و در داخل یکدیگر به حالت آشیانه ای و همچنین در نواحی نزدیک ریزماهواره ها ادغام می شوند. از 58 آغازگر منفرد و ترکیب آغازگری بررسی شده، 20 آغازگر (7 آغازگر IRAP و 13 آغازگر REMAP) الگوی باندی واضح و قابل امتیازدهی تولید نمودند. در مجموع 199 مکان توسط 20 آغازگر تکثیر شد که از این تعداد 129 مکان (8/64 درصد) چندشکل بودند. آغازگرهای LTR1868 و LTR1854-A13 به ترتیب بیشترین و کمترین تعداد مکان چندشکل را تولید نمودند. براساس آزمون مانتل همبستگی بین ماتریس های کوفنتیک IRAP و REMAP معنی دار نبود. تجزیه خوشه ایبراساس داده های حاصل از ترکیب دو نشانگر (IRAP+REMAP) به روش Minimum evolution بر پایه ضریب Number of differences، ژنوتیپ ها را به چهار گروه منتسب کرد. افراد مربوط به هر جمعیت در گروه های مشابه قرار گرفت. براساس نتایج حاصل از این تحقیق می توان اظهار داشت که نشانگرهای IRAP و REMAP توسعه یافته براساس رتروترنسپوزون های فعال در جنس Linum می توانند به عنوان ابزار نسبتا جدیدی در برنامه های اصلاحی گونه های مختلف این جنس مورد استفاده قرار گیرند.

خیار میزبان بسیاری از عوامل بیماریزای خاکزاد می باشد. شبه قارچ Pythium apanidermatumبه عنوان یک عامل خاکزاد، سبب بیماری بوته میری در خیار می گردد. با توجه به توسعه کشاورزی پایدار، استفاده از کودهای بیولوژیک برای مدیریت بیماری های گیاهی امری ضروری خواهد بود. در این تحقیق اثر کود نیتروکسین در مقاومت گیاهچه های خیار (رقم ES-2862) مورد بررسی قرار گرفت. بعد از تیمار گیاهچه های آلوده با نیتروکسین، شدت بیماری در مقایسه با شاهد اندازه گیری شد. از برگ گیاهچه ها برای استخراج RNA کل و بررسی بیان کمی دو ژن مسئول مقاومت در گیاه با PCR زمان واقعی استفاده شد. نتایج این ارزیابی نشان داد که شدت بیماری در اثر اعمال کود نیتروکسین کاهش یافت. همچنین بیان ژن های Chitinase و Cupi4در زمان 24 و 48 ساعت بعد از تلقیح افزایش یافت. میزان بیان ژن Cupi4 نسبت به ژن Chitinase تغییراتبیشتری داشت. نتایج این تحقیق نشان می دهد که کاربرد نیتروکسین می تواند باعث افزایش مقاومت خیار علیه بیماری مرگ گیاهچه شود.

چویل با نام علمی Ferulago angulata B.از گیاهان دارویی مهم و متعلق به خانواده چتریان می باشد. جهت تعیین مناسب ترین نوع ریزنمونه و ترکیب هورمونی برای پینه زایی در این گیاه، آزمایشی در دانشگاه یاسوج با استفاده از ریزنمونه های ریشه، ساقه، برگ (حاصل از کشت جنین) و جنین برش خورده و تیمارهای هورمونی NAA همراه با BAP هرکدام در پنج سطح (0، 5/0، 1، 5/1 و 2 میلی گرم در لیتر) و هم چنین 2،4-D در پنج سطح (0، 1، 2، 3 و 4 میلی گرم در لیتر) همراه با BAP در پنج سطح (0، 5/0، 1، 5/1 و 2 میلی گرم در لیتر) در محیط کشت MS4/1به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار مورد بررسی و آزمایش قرار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که کلیه اثرهای اصلی، برهمکنش های دوگانه و برهمکنش ریزنمونه، NAA وBAP برای درصد پینه زایی، وزن تر پینه، وزن خشک پینه، طول پینه، قطر پینه و حجم پینه معنی دار شد. در آزمایش دیگر نیز نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که کلیه اثرهای اصلی، برهمکنش های دوگانه و برهمکنش ریزنمونه و 2،4-D وBAP برای درصد پینه زایی، وزن تر پینه، وزن خشک پینه، طول پینه، قطر پینه و حجم پینه معنی دار شد. براساس مقایسه میانگین ها، ریزنمونه ریشه در تمام غلظت های NAA صرف نظر از غلظت های مختلف BAP جهت تولید پینه موثرتر بود. همچنین در تیمارهای هورمونی 2،4-D همراه با BAP نیز، ریزنمونه ریشه در ترکیب هورمونی 1 میلی گرم در لیتر 2،4-D همراه با 5/1 میلی گرم در لیتر BAP مناسب ترین ریزنمونه و ترکیب هورمونی از نظر ویژگی های درصد پینه زایی، وزن تر پینه، وزن خشک پینه، طول پینه، قطر پینه و حجم پینه بودند. نظر به واکنش خوب چویل به پینه زایی می توان از این نتایج برای اهداف مختلف اصلاحی استفاده نمود.

ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته دارها (Prunus necrotic ringspot virus، PNRSV)، یکی ازمخرب ترین ویروس های گیاهی است که می تواند باعث کاهش رشد و عملکرد در درختان میوه هسته دار شود. در این مطالعه شیوع این بیماری در درختان بادام با هدف شناسایی مطمئن این ویروس با دو روش RT-PCR و الایزا در باغ های بادام منطقه ی سامان در استان چهارمحال و بختیاری و تاثیر آن بر جوانه زنی دانه گرده بررسی شد. 100 درخت از ارقام مامایی، ربیع و سفید انتخاب و نمونه هایی از آنها در سه ماه فروردین، تیر و مهر در سال زراعی 89-1388 جمع آوری گردید. پس از تایید آلودگی در نمونه ها با آزمون الایزا به روش مستقیم و روش RT-PCR، دانه های گرده رقم سفید تحت شرایط آزمایشگاهی کشت شدند و درصد جوانه زنی دانه های گرده آلوده و سالم مقایسه شد. نتایج نشان داد تنها 34 درصد دانه گرده درخت آلوده قادر به جوانه زنی هستند. همچنین مشخص گردید زمان نمونه برداری در ردیابی ویروس اهمیت داشته و بهترین زمان نمونه برداری برای آشکارسازی ویروس فروردین ماه تعیین شد. مقایسه دو روش RT-PCR و الایزا نشان داد که حساسیت RT-PCR در آشکارسازی بیماری لکه حلقوی بافت مرده هسته دارها بیشتر از آزمون الایزا می باشد.

اسپرجیلوس نایجر یکی از ریزجاندارهایی است که برای تولید پروتئین تک یاخته به کار رفته است. این قارچ ریسه ای که توانایی تراوش انواع آنزیم را دارد می تواند بر سطح زیادی از سوبسترا رشد کند و از آن جا که مقدار زیادی پروتئین برون سلولی تولید می کند هم می توان بستر رشد آن را از پروتئین درون سلولی قارچ پرمایه کرد و هم می توان پروتئین ترشح شده را با حلال به سادگی بیرون کشید. راندمان رشد قارچ از آن جا که در حالت طبیعی بر روی جامدات پکتینی رشد می کند بر بستر جامد اغلب بیشتر از حالت مایع است. گلبرگ زعفران که در حال حاضر یکی از ضایعات کشاورزی است، می تواند به عنوان بستر کشت جامد مورد استفاده قرارگیرد. در این تحقیق با کشت بستر جامد اسپرجیلوس نایجر بر روی گلبرگ خشک شده زعفران در یک دوره 15 روزه، پروتئین آن با دو حلال متفاوت بیرون کشیده شده و به دو روش لری و بیوره سنجیده شد. بیشترین میزان پروتئین سنجیده شده به روش بیوره با حلال آب خالص 53/98 میلی گرم در هر یک گرم گلبرگ خشک آغازین و با حلال سود و بافر کربنات 167 میلی گرم در هر یک گرم گلبرگ خشک آغازین برآورد شد.

توتون، یکی از گیاهان مهم صنعتی است که در اقتصاد و درآمد کشورهای تولیدکننده نقش بسیار مهمی دارد. Potato Virus Y یکی از مهم ترین بیماری های ویروسی خسارت زا روی توتون است و باعث کاهش کمیت و کیفیت محصول توتون می گردد. ویروس Y سیب زمینی (PVY) متعلق به جنس Potyvirus است که گیاهان خانواده سولاناسه مانند سیب زمینی، توتون و گوجه فرنگی را آلوده می کند. موثرترین و بهترین روش برای کاهش خسارت این ویروس، اصلاح ارقام مقاوم یا متحمل نسبت به این ویروس است. نشانگرهای DNA پیوسته با ژن های مقاومت و دارای چندشکلی زیاد، مانند نشانگرهای SSR می توانند در تسریع برنامه های اصلاح ارقام مقاوم مفید باشند. این تحقیق به منظور ارزیابی مقاومت نسبی توتون نسبت به بیماری ویروس Yسیب زمینی با استفاده از نشانگرهای SSR اجرا شد. جهت اجرای این تحقیق رقم VAMمقاوم به ویروس PVY با رقم K326 حساس به این بیماری تلاقی داده شد. تلاقی اولیه در سال 1389 انجام شد، در سال1390 بذور F1 کشت شده و بذور F2 به دست آمده بود. بذور F2 حاصل در سال 1390 در مزرعه تحقیقاتی مرکز تحقیقات و آموزش توتون تیرتاش کشت شدند. در طول دوره رشد، عملیات زراعی لازم به موقع انجام پذیرفت و ارزیابی مزرعه ای (مورفولوژیکی) از نظر علائم آلودگی به بیماری PVY از بین گیاهان کشت شده در مزرعه هر دو هفته یک بار صورت گرفت. سپس، گیاهان F2 به دست آمده با جدایه خالص سازی شده سویه O ویروس PVY مایه زنی شدند. در ادامه کار از تعداد 10 بوته متحمل و 10 بوته حساس، براساس علایم مزرعه ای نمونه برگ تهیه گردید. روی این نمونه ها برای تایید مقاومت و حساسیت به PVY آزمون الایزا انجام شد و براساس نتایج الایزا ژنوتیپ های حساس و مقاوم شناسایی شدند. DNA ی مربوط به بوته های والد حساس و مقاوم به بیماریPVY به طور جداگانه به روش دلاپورتا استخراج شده و جهت تهیه نمونه های بالک (توده) حساس و مقاوم، DNA ی نمونه های حساس با یکدیگر و DNA ی نمونه های مقاوم با هم مخلوط شدند. در ادامه100 جفت آغازگر SSR انتخابی روی دو رقم والدینی تست شد. نتایج نشان داد که از بین 100 جفت آغازگر مورد استفاده در این تحقیق، 28 جفت آغازگر توانستند الگوی نواربندی متفاوتی را برای هر نشانگر در بین والدین مقاوم و حساس به PVY نشان دهند. در مرحله بعد این 28 نشانگر بر روی بالک حساس و مقاوم تست شد تا نشانگر پیوسته با ژن مقاومت شناسایی گردد. مشخص شد که 3 نشانگر SSR (PT30002)، (PT20165)، (PT20357) دارای بیشترین چندشکلی بوده و می توانند به عنوان نشانگر پیوسته به ژن مقاومت به بیماری PVY در برنامه های اصلاحی توتون مدنظر قرار گیرند.