فصلنامه ژنتیک نوین
سال هفتم شماره 4 (پیاپی 31، زمستان 1391)

ریز سازواره ها پایه و اساس حیات بر روی کره زمین بوده و درجه بالایی از تنوع زیستی را عرضه می نمایند. این تنوع عظیم ژنتیکی و زیستی می تواند در جهت افزایش شناخت ژن های جدید، مسیر های متابولیک و محصولات آن مورد استفاده قرار گیرد. شناسایی تنوع ژنتیکی و زیستی ریز سازواره ها بخش مهمی از تحقیقات علمی را تشکیل می دهد. بسیاری از ریز سازواره هارا نمی-توان در شرایط آزمایشگاه کشت داد که این موضوع در درک فیزیولوژی، ژنتیک و اکولوژی جامعه میکروبی محدودیت ایجاد می نماید. راه حل مناسب رفع این مشکل استفاده از دانش و ابزاری جامع به نام متاژنومیکس یعنی همسانه سازی با استفاده از روش های مستقل از کشت است. یکی از بهترین روش ها در هدف گیری ژن در متاژنومیکسPCR-DGGE است که در آن محصول PCR DNA استخراج شده از جوامع میکروبی، به کمک آغازگرهای اختصاصی 16S rRNA در گروه های عمده میکروبی مانند باکتری ها، آرکی ها و استفاده از آغاز گرهای18S rRNA در گروه های یوکاریوتی به دست می آید که نتیجه آن تکثیر قطعاتی هم اندازه و با طول یکسان می باشد. DGGE تکنیکی برای جداسازی قطعات اسید نوکلئیک است که از لحاظ اندازه توالی یکسان بوده اما به لحاظ محتوای توالی متفاوت هستند. با استفاده از روش DGGE، تشخیص بیماری های میکروبی و شناسایی ریز سازواره هادر مقیاس بزرگ می تواند ساده تر و سریع تر به دست آید. در این بررسی سعی شده به طور خلاصه به مکانیسم اجرا، کاربردها، مزایا و معایب این فناوری پرداخته شود.

ماهی آزاد دریای خزر Salmo trutta caspius از جمله ماهیان مهاجر بومی دریای خزر است که به ویژه در سال های اخیر در معرض خطر انقراض قرار گرفته است. تشخیص زودهنگام جنسیت در ماهی آزاد به منظور تولید جنس ماده از اهمیت بالایی در امر پرورش برخوردار است. با توجه به اینکه در بررسی نشانگرهای تعیین جنسیت برخی آزادماهیان استفاده از نشانگر مولکولی AFLP روشی کارآمد و سریع برای شناسایی نشانگرهای دارای پیوستگی جنسی معرفی شده است، لذا در این تحقیق به منظور امکان سنجی تعیین جنسیت ماهی آزاد دریای خزر، از انتهای باله دمی 10 عدد ماهی ماده و 10عدد ماهی نر نمونه برداری شد و با استفاده از نشانگر مولکولی AFLP با 96 ترکیب آغازگری مختلفEcoRI و MseI، جهت تعیین نشانگر مرتبط با جنسیت استفاده شد. نتایج حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از 96 ترکیب مختلف آغازگر، مبین ایجاد باندهای متفاوت در نرها و ماده ها در حداقل 15 ترکیب آغازگری در مرحله اول بود، اما باندهای مورد نظر، در تکرار بر روی نمونه های دیگر در مراحل دوم و سوم، به طور اختصاصی در یک جنس مشاهده نشدند، که نشان دهنده عدم پیوستگی این نشانگرها به جنسیت و نرخ نوترکیبی بالاتر بوده است. با توجه به نتایج، استفاده از سایر ترکیبات آغازگرها به منظور یافتن نشانگر جنسی اختصاصی در ماهی آزاد دریای خزر توصیه می شود.

به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 30 توده آژیلوپس تائوشی با استفاده از 17 جفت نشانگر ریزماهواره، در مجموع تعداد 71 آلل شناسایی شد که 69 آلل دارای چند شکلی بودند. میانگین تعداد آلل در کل لوکوس ها برابر 6/4 و میانگین محتوای چند شکلی مقدار 654/. بود. بیشترین میزان عدم تشابه بین دو ژنوتیپ 3 و 12 و کمترین میزان عدم تشابه بین دو ژنوتیپ 7 و 10 مشاهده شد. بیشترین و کمترین فاصله ژنتیکی به ترتیب در روش دایس مقدار 85/0 و 265/0 و در روش جاکارد 92/0 و 42/0 محاسبه شد. بررسی میزان عدم تشابه بین ژنوتیپ ها نشان داد که ژنوتیپ های ایرانی تنوع بیشتری نسبت به ژنوتیپ های خارجی دارند و در بین آن ها، ژنوتیپ های نواحی شمالی (مازندران و گیلان) به ویژه ژنوتیپ های استان مازندران متنوع ترند. بنابراین نواحی شمال ایران به ویژه مازندران مرکز تنوع ژنوتیپ ها و خاستگاه اصلی گونه آژیلوپس تائوشی بوده و به نظر می رسد این گونه از این نقاط به سایر مناطق انتقال یافته است.

آلکالوئیدهای گروه مورفین در خشخاش از دو مولکول اسید آمینه ال– تیروزین توسط حداقل 17 مرحله آنزیمی طی چندین واکنش اکسیداتیو پیوسته سنتز می شوند. اولین آنزیم کلیدی در این مسیر ال– تیروزین دکربوکسیلاز(TYDC) می باشد. تیروزین دکربوکسیلاز یک آمینو اسید دکربوکسیلاز حلقوی رایج و عمومی در گیاهان می باشد که در گونه های مختلف گیاهی بیوسنتز تعداد زیادی از متابولیت های اولیه و ثانویه به آن وابسته می باشد. به منظور تشدید بیان این ژن در گیاه خشخاش، سازه ژنی مناسب به نام pBI121-TK، طراحی شد. بدین ترتیب که توالی کوزاک به عنوان یک افزایش دهنده بیان ژن در بالا دست کدون شروع ژن TYDC2 الحاق و در پلاسمید حد واسط pTZ57R/T درج شد و سپس در ناحیه T-DNA پلاسمید دوتایی pBI121، در جایگاه ژن GUS تحت پیشبر CaMV35S و پایان بر Nos وارد شد. نتایج کلونینگ با استفاده از روش های مختلف مولکولی از جمله برش آنزیمی، PCR و کلونی PCR در هر مرحله از آزمایش بررسی و تایید شد. بهینه سازی انتقال ژن به روش آزمون هیستوشیمیایی GUS در گیاهان اگرواینفیلتره شده توسط پلاسمید pBI121 حاوی ژن GUS انجام شد و در نهایت اگروباکتری حاوی سازه نوترکیب pBI121-TK مطابق با شرایط بهینه شده، به گیاهان شش هفته ای تلقیح شد. میزان آلکالوئیدهای گروه مورفین با دستگاه HPLC اندازه گیری شد. نتایج حاصل نشان دهنده افزایش 2/75 درصدی آلکالوئیدهای مورفین، کدئین و تبائین در نمونه تراریخته نسبت به نمونه شاهد بود.

در این مطالعه نشانگر RAPD به عنوان ابزاری برای بررسی میزان تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیت های لاله ی واژگون (F. imperialis) مورد استفاده قرار گرفت. بدین منظور ابتدا 160 نمونه، از هشت جمعیت F. imperialis از مناطق مختلف زاگرس جمع آوری شد. شش آغازگر از 35 آغازگر بکار رفته بر اساس میزان پلی مورفیسم آن ها انتخاب شدند. نتایج نشان داد که از 81 باند تولید شده 71 باند به صورت پلی مورف بودند. بر اساس تجزیه خوشه ایبا استفاده از ضریب تشابه جاکارد، و با استفاده از روش UPGMA مشخص شد که تفاوت معنی داری بین جمعیت ها وجود دارد. تجزیه واریانس مولکولی نیز نشان داد که میزان تنوع ژنتیکی بین جمعیت ها و درون جمعیت ها به ترتیب برابر با 45 و 55 درصد می باشد. بر اساس تجزیه های تنوع ژنی میزان تنوع ژنی کل (Ht) برابر با 234/0 و میزان تنوع ژنی درون جمعیت ها (Hs) برابر با 138/0 و همچنین میزان تنوع ژنی بین جمعیت ها (Gst) برابر با 408/0 برآورد شد. نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی نسبتا کمی درون جمعیت ها و نسبتا زیاد بین جمعیت های لاله ی واژگون وجود دارد. فاصله جغرافیایی زیاد عامل اصلی محدویت انتقال ژن بین جمعیت ها و تمایز ساختار ژنتیکی جمعیت های لاله ی واژگون منطقه زاگرس بیان شد.

ریشه های موئین، نقش مهمی در جذب آب و مواد غذایی از خاک بازی می کنند و به عنوان جایگاهی برای اثر متقابل با میکرواگانیسم های خاک محسوب می شوند. فرایند شکل گیری ریشه های موئین در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا شناخته شده می باشد. ژنهای متعددی در توسعه سلول های گیاهی نقش دارند که در این تحقیق یک ژن اختصاصی ریشه به نام AtEXPA18 که به طور مستقیم در شکل گیری ریشه های موئین موثر است، جداسازی و تحت کنترل پیشبرنده CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS درون ناقل بیان گیاهی pBI121 کلون و در نهایت به باکتری آگروباکتریوم منتقل گردید. باکتری آگروباکتریوموم حاوی ناقل بیانی گیاهی pBI:EXPA18 طی روش غوطه وری گل آذین به آرابیدوپسیس منتقل شد. بذور حاصل از غوطه وری گل آذین جهت ارزیابی اولیه تراریخته بودن روی محیط انتخابی حاوی کانامایسین گزینش شدند و به منظور تایید تراریخته بودن گیاهان، آنالیز مولکولی گیاهان رشد کرده روی محیط حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین به روش RT-PCR انجام شد. بدین صورت که با به کارگیری آغازگر های اختصاصی ژن nptII و AtEXPA18 و همچنین cDNA گیاهان تراریخته واکنش PCR انجام و تراریختگی گیاهان در سطح رونویسی تایید شد.

عملکرد گندم (Triticum aestivum L.)به عنوان مهمترین گیاه زراعی همواره تحت تاثیر تنش های محیطی بوده و امروزه دستیابی به عملکردی مطلوب و پایدار همواره مد نظر محققین بوده است. از آنجا که تنوع پروتئینی بخش مهمی از پاسخ گیاه به تنش محیطی و نیز سازگاری با شرایط محیطی به شمار می رود، تغییرات کمی و الگوی نواری پروتئین محلول در دو اندام (ریشه چه و ساقه چه) گیاهچه های دو رقم حساس (قدس) و متحمل (الوند) گندم نان مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که اثر رقم، تنش، اندام و نیز اثرات متقابل تنش× رقم و تنش× اندام باعث تغییرات معنی داری بر محتوای پروتئین محلول شدند. در ریشه چه به غیر از سطوح تنش شوری، سایر تنش ها تفاوت معنی داری نسبت به شاهد نشان دادند. همچنین در ساقه چه به جز سطح اول تنش های خشکی و شوری، بقیه نسبت به شاهد افزایش معنی داری داشتند. در رقم الوند به غیر از دمای پایین و سطح دوم شوری و در رقم قدس به جز سطح دوم خشکی سایر سطوح تفاوت معنی داری با شاهد نشان ندادند. همچنین الگوهای نواری متفاوتی بر روی ژل SDS-PAGE در اندام های ارقام تحت تنش های مختلف مشاهده شد.

ارزیابی تنوع ژنتیکی و ایجاد کلکسیون های مرکزی ژرم پلاسم برای تسهیل مدیریت ژرم پلاسم و ارزیابی بهتر منابع ژنتیکی در برنامه های اصلاحی ضروری می باشند. علیرغم تنوع مورفولوژیکی بالا در ژرم پلاسم یونجه، این تنوع به اندازه کافی در برنامه-های اصلاحی مورد توجه قرار نگرفته است. بنابراین آزمایشی به منظور تعیین تنوع ژنتیکی 110 ژنوتیپ متعلق به 11 جمعیت مختلف یونجه زراعی با استفاده از 13 صفت مورفولوژیک در شرایط مزرعه ای انجام شد. جمعیت ها از نظر کلیه صفات مورد بررسی تفاوت معنی دار آماری (01/0P <) داشتند. ضرایب تنوع فنوتیپی و ژنوتیپی برای اکثر صفات بالا بود. نتایج ضرایب همبستگی بین صفات نشان داد که هر چه وزن ساقه در یونجه بیشتر باشد، وزن برگ های بوته نیز بیشتر خواهد شد. بر اساس نتایج تجزیه به مولفه های اصلی، سه مولفه اول تقریبا 1/88 درصد از تغییرات کل را توجیه نمود. مولفه اول با صفات وزن تر کل، وزن خشک کل، وزن تر برگ، وزن تر ساقه و وزن خشک ساقه و مولفه دوم با صفات نسبت وزن خشک برگ به ساقه و تعداد برگ و همچنین مولفه سوم با صفات میزان کلروفیل و ارتفاع بوته ارتباط مثبتی نشان داد. نتایج تجزیه کلاستر، جمعیت های مورد بررسی را در دو گروه اصلی قرار داد که هر کدام شامل دو زیر گروه بودند. ارزیابی تنوع فنوتیپی موجود، می تواند اطلاعات مفیدی در مدیریت کلکسیون ها فراهم آورد و در شناسایی جمعیت های مناسب برای اهداف اصلاحی مختلف در یونجه مفید باشد.

ویروس موزاییک کوتولگی ذرت (Maize Dwarf Mosaic Virus، MDMV) یکی از مهمترین و گسترده ترین پوتی ویروس-های ذرت در دنیا محسوب می شود. به منظور تعیین جایگاه تاکسونومیکی ویروس جدایه استان گلستان در میان پوتی ویروس های غلات و سایر سویه های MDMV و قرابت آن با سویه های سایر کشورها، گیاهان ذرت و قیاق با علائم موزاییک و کوتولگی در سال زراعی 1389 از مزارع استان گلستان جمع آوری شد. نمونه های آلوده به MDMV با آنتی سرم این ویروس در آزمون الایزای غیر مستقیم مشخص شد. نمونه آلوده به MDMV انتخاب و RNA ویروسی آن استخراج شده، سپس ناحیه /3 ژنوم آن با استفاده از آغازگرهای عمومی پوتی ویروس ها و اختصاصیMDMV به روش RT-PCR تکثیر و همسانه سازی شد. ترادف استنتاجی ناحیه CP-UTR، قطعه ای به طول 1107 نوکلئوتید بود. این ترادف با ترادف سایر جدایه های MDMV موجود در بانک ژن و نیز پوتی ویروس های دیگر غلات مورد مقایسه قرار گرفت و درخت فیلوژنتیکی حاصل از این ترادف ها به روش neighbor-joining بدست آمد. در این تجزیه فیلوژنتیکی، 46 ترادف در 6 گروه شامل SrMV، ZeMV، PenMV، JGMV، SCMV و MDMVقرار گرفت و جدایه گلستان در کنار جدایه ای از کشور بلغارستان گروه مشترکی تشکیل دادند. نتایج این آزمایش نشان می دهد احتمالا منشاء جدایه های MDMV در ایران کشورهای اروپایی یا بطور دقیق تر حوزه مدیترانه باشد

گزینش لاین های مطلوب نرعقیم از نظر خصوصیات آلوگامی و صفات موثر بر افزایش میزان بذر تشکیل شده در A لاین ها از ضروریات برنامه برنج هیبرید می باشد. صفاتی همچون طول بساک، درصد خروج خوشه، درصد عقیمی گرده، طول میله پرچم، طول کلاله، طول گلوم و تعداد گلچه از جمله صفات مهم بر افزایش دگرگشنی و مطلوبیت لاین های نرعقیم می باشند. در تحقیق حاضر از 7 لاین نرعقیم سیتوپلاسمی (A لاین) و نگهدارنده آنها (B لاین) و تعداد 33 لاین نرعقیم اصلاح شده حاصل از تلاقی برگشتی ارقام ایرانی با لاین های نرعقیم معرفی شده از ایری به همراه لاین والدینی در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی با سه تکرار استفاده گردید. صفات طول بساک، درصد خروج خوشه، درصد عقیمی گرده، درصد عقیمی خوشه، طول میله پرچم، طول کلاله، طول گلوم، اندازه گلچه، عرض گلچه، تعداد گلچه، درصد دگرگشنی، تعداد روز تا شروع گلدهی و تعداد روز تا پایان گلدهی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی عقیمی دانه گرده نشان داد که لاین هایی همچون ندا A، نعمت A، شصتک محمدی A و گرده دارای عقیمی کامل دانه گرده و خوشه می باشند. القای سیتوپلاسم عقیم به این لاین ها موجب شده تا خوشه، خروج کامل نداشته باشد. مقایسه میانگین صفات نشان داد که لاین نرعقیم حسنی ریشک قرمز A دارای بلندترین طول کلاله (93/2 میلی متر) و کوتاهترین طول کیسه بساک (87/1 میلی متر) بود. درصد دگرگشنی در این لاین و خزرA بسیار پایین (صفر درصد) بود. لاین نرعقیم IR69224A ضمن داشتن عقیمی کامل، درصد دگرگشنی بالایی (79/37 =) نیز داشته است. صفات درصد عقیمی گرده، تعداد گلچه در خوشه، طول گلوم و طول میله پرچم ضریب تغییرات ژنوتیپی، وراثت پذیری و پیشرفت ژنتیکی بالایی نسبت به سایر صفات داشته، در نتیجه این صفات را می توان بعنوان معیار انتخاب در لاین های نرعقیم سیتوپلاسمی با میزان دگرگشنی بالا در نظر گرفت. نتایج حاصل از تجزیه خوشه اینشان داد که لاین های نرعقیم دشت (دشت × IR68899A)، خزر، حسنی، گرده، سنگ طارم، شصتک محمدی به همراه لاین های نگهدارنده خود هر کدام بطور جداگانه در کنار هم قرار گرفتند. بنابراین مشخص می شود که این لاین ها نیز بعد از چندین نسل تلاقی برگشتی به خلوص بالایی رسیده اند. از نتایج این تحقیق می-توان جهت انتخاب والدین مناسب و استفاده از آنها جهت پروژه های اصلاحی مبتنی بر هیبریداسیون و دیگر روش ها به منظور یافتن نتاج با عملکرد بالا استفاده نمود.

نتایج مطالعات ژنوم گیاهان مختلف تا سال 1998 مشخص کرد که حدود 50 درصد از ژن هایی که جدید شناسایی می شوند، دارای توالی های مشابه و آرایش حفاظت شده ژنومی در مقایسه با ژن هایی هستند که در گذشته شناخته شده اند. این یافته اساس پیدایش ژنومیکس مقایسه ای شد. در این راستا با بهره گیری از ریز تشابهات ژنومی و همراستایی مولکولی بین ژنوم توالی یابی نشده جو در مقایسه با ژنوم های توالی یابی شده خانواده پواسه (گرامینه) نظیر برنج، ذرت، سورگوم و براکی پودیوم، مکان ژن فشردگی سنبله (dsp.ar) در ناحیه سانترومری کروموزوم H7 جو مورد مطالعه قرار گرفت. ژن مزبور از جمله ژن های تکاملی و مرتبط با مورفولوژی سنبله و کنترل عملکرد در جو می باشد که از جنبه های اقتصادی حائز اهمیت است. تفرق 3:1 فنوتیپی فشردگی سنبله در بین نتاج F2 حاصل از تلاقی والدین Bowman و BW265 نشان داد که توارث ژنتیکی این صفت بصورت ساده مندلی و با یک ژن کنترل می گردد. با ابداع نشانگرهای جدید STS، SNP و EST و تبدیل آنها به نشانگرهای مبتنی بر PCR به روش CAPS و Pyrosequencing امکان اشباع نقشه پیوستگی مولکولی در این ناحیه و مکان یابی ژن فشردگی سنبله (dsp.ar) فراهم شد. در بین 1993 فرد متعلق به این جمعیت 39 لاین شناسایی گردید که برای 40 نشانگر تولید شده نوترکیبی نشان دادند. از نشانگرهای SC57808وCAPSK06413 پیوسته با ژن مذکور در فاصله ای کمتر از یک سانتی مورگان جهت اصلاح به کمک نشانگر و همسانه سازی این ژن بر اساس نقشه استفاده خواهد شد. روش استفاده شده در این تحقیق قابل تعمیم به سایر ژن ها و ژنوم های گیاهی جهت بهره گیری از آن در اصلاح نباتات مولکولی است که به تفصیل به شرح آن پرداخته خواهد شد.

در این تحقیق چندشکلی ناحیه پروموتور ژن فاکتور رشد شبه انسولین یک (IGF1) مرغان بومی آذربایجان غربی شناسایی شد. برای این منظور از تعداد 100 قطعه مرغ بومی ایستگاه اصلاح نژاد مرغ بومی آذربایجان غربی خونگیری شد. پس از استخراج DNA، قطعه ای به اندازهbp 813 از ناحیه پروموتور این ژن با استفاده از تکنیک PCR تکثیر شد. قطعه تکثیر شده بوسیله آنزیم محدود کننده HinfI مورد برش قرار گرفت و بر روی ژل آگارز دو درصد الکتروفورز شد. نتایج حاصل حاکی از وجود دو آلل A و C در این جایگاه بود که فراوانی آنها در کل جمعیت بترتیب 5/24 درصد و 5/75 درصد محاسبه شد. سه ژنوتیپ AA، AC و CC شناسایی شدند که فراوانی های ژنوتیپی محاسبه شده آنها در کل جمعیت بترتیب برابر 5 درصد، 39 درصد و 56 درصد بود. آزمون مربع کای برای این ناحیه از ژن IGF1 در جمعیت طیور مورد مطالعه، بیانگر برقراری تعادل هاردی-واینبرگ بود. بر اساس نتایج بدست آمده از این پژوهش می توان نتیجه گیری کرد که چند شکلی ناحیه پروموتور ژن IGF1 مرغ بومی نسبتا بالا بوده به طوریکه می تواند در برنامه های اصلاح نژاد طیور بومی کشور، ارتباط این چندشکلی ها با صفات اقتصادی مورد ارزیابی قرار گیرد.