کلون، بیان و تخلیص پروتئین P647-153هموفیلوس آنفلوانزا

هموفیلوس آنفلوانزا، باسیل گرم منفی است که بخشی از میکروفلور نازوفارنکس را در اغلب افراد تشکیل داده و سویه های مختلف آن در دو گروه کپسولدار (قابل طبقه بندی) و بدون کپسول (غیرقابل طبقه بندی) مورد مطالعه قرار می گیرد. پروتئین غشاء خارجی P6، نوعی ایمونوژن حفاظت شده و پایدار درمیان سویه های فاقد کپسول و نیز سویه های کپسولدار هموفیلوس آنفلوانزا می باشد و خود بعنوان کاندید مناسبی جهت واکسیناسیون علیه هموفیلوس آنفلوانزا مطرح گردیده است. هدف از این مطالعه، تولید و تخلیص آنتی ژن نوترکیب P6 به عنوان یک پروتئین حامل در واکسنهای کونژوگه می باشد.
قطعه ای به طول324 جفت باز از بخش انتهای ژن کد کننده پروتئین P6در حامل پلاسمیدی pJET1.2 و متعاقبا در pET28a(+) کلون شد. القای تولید پروتئین با یک میلی مولار IPTG صورت گرفت و تخلیص آن با حل کردن اجسام سلولی در اوره، جذب با رزین نیکل، حذف اوره با شیب کاهشی اوره در محلول های شستشو و نهایتا جمع آوری پروتئین نوترکیب به شکل محلول در ایمیدازول انجام شد. حذف ایمیدازول با دیالیز در برابر بافرفسفات نمکی صورت پذیرفت. پروتئین نوترکیب P647-153 با استفاده از آنتی سرم پلی کلونال خرگوشی ضد هموفیلوس آنفلوانزا با استفاده از روش وسترن بلات تایید گردید.
پروتئین نوترکیب P647-153در میزبان DE3) E. coli BL21) با موفقیت بیان و تخلیص گردید (حدود 4 میلی گرم درهر لیتر کشت مایع LB). ساختار آنتی ژنی پروتئین نوترکیب P6 نیز با استفاده از ایمونوبلاتینگ تایید شد.
نتایج وسترن بلات به موازات نتایج تعیین توالی، حاکی ازصحت تولید پروتئین P647-153 نوترکیب و حفظ نسبی ساختار اپیتوپی آن می باشد.