جداسازی، بیان ژن و تولید پروتئین افکتور PthA باکتری Xanthomonas citri subsp citri عامل بیماری شانکر مرکبات

بیماری شانکر باکتریایی مرکبات از جمله مهمترین بیماری های باغات لیموی مکزیکی در جنوب کشور می باشد که توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می شود. پروتئین PthA باکتری عامل شانکر مرکبات، به عنوان پروتئین افکتور، نقش اساسی در فرایند بیماری زایی دارد و لذا غیر فعال سازی آن با استفاده از آنتی بادی می تواند منجر به ایجاد مقاومت بر علیه بیماری شود. در این تحقیق جداسازی و بیان ژن pthA و خالص سازی پروتئین حاصل از آن صورت پذیرفته است. برای این منظور با استفاده از منابع اطلاعاتی بانک ژن، آغازگرهای اختصاصی برای جداسازی ژن pthA طراحی شد و سپس قطعه ژنی مربوطه در ناقلpTZ57R/T همسانه سازی گردید. ژن مزبور سپس به صورت متصل به دنباله شش تایی هیستیدین در ناقل بیانی باکتریایی pET28a همسانه سازی گردیده و بیان آن به صورت نوترکیب در سویه BL21(DE3) باکتری Escherichia coli صورت پذیرفت. خالص سازی پروتئین نوترکیب PthA در شرایط طبیعی غیر واسرشتی و با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. صحت بیان پروتئین مذکور با روش های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی توالی شش تایی هیستیدین مورد بررسی و تایید قرار گرفت. پروتئین نوترکیب خالص بدست آمده می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید آنتی بادی های نوترکیب مونوکلونال مورد استفاده قرار گیرد.