موتاسیون هدف مند، کلونینگ و بیان پروتئین استرپتوکیناز به منظور تولید مولکول جدید مناسب برای پگیلاسیون

استرپتوکیناز رایج ترین و در حال حاضر مقرون به صرفه ترین داروی فیبرینولیتیک برای درمان سکته های قلبی و گرفتگی رگ ها می باشد. علی رغم مزایا و برتری هایی که استرپتوکیناز نسبت به داروهای ترومبولیتیک دیگر دارد، تجویز آن می تواند با مشکلاتی از جمله تحریک سیستم ایمنی بدن و هموراژی همراه بوده و هم چنین نیمه عمر نسبتا پایین آن منجر به درمان ناقص شود. پگیلاسیون یکی از روش های رایج برای اصلاح برخی از این معایب می باشد.
در تحقیق حاضر برای طراحی و تولید پروتئینی مناسب برای پگیلاسیون اختصاصی با سیستئین، نرم افزار SPDBviewer استفاده شد. پس از انجام موتاسیون هدف مند به روش SOEing PCR، ژن موتانت (sk45cys) و غیرموتانت (ski) به درون وکتور pET26-b وارد شده و ساختارهای حاصل به درون اشرشیاکلی ترنسفرم شدند. کلون های حاصل پس از رشد توسط IPTG بیان شده و بیان پروتئین ها توسط SD-PAGE و وسترن بلاتینگ بررسی گردید. پروتئین ها با تکنیک افینیتی کروماتوگرافی با ستونNi-NTA تخلیص شدند و فعالیت آن ها با استفاده از روش کروموژنیک و از طریق سوبسترای S2251 بررسی شد.
نتایج حاصل از فعالیت سنجی نشان داد که فعالیت آمیدولیتیک sk45cys در مقایسه با ski، پس از 30 دقیقه از تشکیل کمپلکس با پلاسمینوژن، 10 درصد افزایش فعالیت داشته است.
نتایج نشان دادند که با توجه به سطحی بودن مکان سیستئین جایگزین شده و هم چنین افزایش نسبی فعالیت SK45cys این پروتئین می تواند مولکول مناسبی برای انجام فرآیند پگیلاسیون اختصاصی باشد.