ردیابی ویروئیدهای مرکبات با روش استخراج اسید نوکلئیک توسط CF-11

بیماری های کاچکسیا ناشی از ویروئیدCitrus Cachexia viroid، CCaVd و اگزوکورتیس ناشی از ویروئید Citrus exocortis viroid، CEVd مهم ترین بیماری های ویروئیدی مرکبات در جهان هستند. ویروئیدها با روش های متداول سرولوژیکی قابل شناسایی نبوده و روش های فعلی تشخیص آنها عموما وقت گیر، پر هزینه و با محدودیت هایی همراه است. در این بررسی امکان خالص سازی و شناسایی دقیق این ویروئیدها با استفاده از ستون کروماتوگرافیCF-11 بررسی شد. طی سال های1390 تا 1392، از سرشاخه های22 درخت نارنگی و 15 درخت پرتقال به ترتیب واجد علائم بیماری های کاچکسیا و اگزوکورتیس در شرق مازندران نمونه برداری شد. بافت برگ پس از پودر شدن با بافر استخراج مخلوط شد. خالص سازی در ستون حاوی پودر سلولز انجام و با افزودن اتانول، مولکول های آر ان ای دو رشته ای استخراج و توسط استات سدیم رسوب داده شد. رسوب حاصل در آگارز یک درصد الکتروفورز و دو باند اختصاصی در محدوده های 300 تا 400 جفت باز (فرم خطی) و7800 -7000 جفت باز (فرم حلقوی) مرتبط با این دو ویروئید به دست آمد که به ترتیب در ماه های گرم و در تمامی ماه های سال با این روش قابل شناسایی بود. ماهیت RNA دورشته ای باندهای به دست آمده، با عدم تخریب آنها توسط آنزیم DNase وهمچنین RNase در حضور محلول نمک طعام 0.3 مولار و حلالیت آن ها در محلول LiCl تایید شد. ماهیت ویروئیدی باندهای به دست آمده توسط واکنش زنجیره ای پلی مراز (RT-PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی CEVd و CCaVd تعیین گردید. تعداد 500 نهال پرتقال و 300 نهال نارنگی در آزمون سلامت نهال با این روش بررسی شد.با توجه به تکرار پذیری و قابل اعتماد بودن این روش و تایید ماهیت باندهای به دست آمده با آغازگر اختصاصی هر یک از این دو ویروئید در واکنش زنجیره ای پلی مراز، این روش برای تشخیص ویروئیدهای مرکبات در برنامه های کاربردی تولید نهال سالم با صرف حداقل زمان و هزینه پیشنهاد می گردد.