همسانه سازی و بهینه سازی بیان هترولوگ لاکاز در pichia pastoris و تعیین برخی از خصوصیات بیوشیمیایی آن

لاکازها آنزیم هایی حاوی مس می باشند که اکسیداسیون ترکیبات آروماتیک و غیرآروماتیک را از طریق احیای مولکول آب به اکسیژن کاتالیز می کنند . همچنین به دلیل قابلیت اکسیداسیون طیف وسیعی از ترکیبات فنلی کاربرد وسیعی در صنعت دارند. در این مطالعه توالی نوکلئوتیدی ژن لاکاز بر اساس ترجیح کدونی میزبان مخمری Pichia pastoris GS115 بهینه شد، سپس توسط شرکت اینویتروژن سنتز و در حامل بیانی pPICZ alpha A همسانه سازی شد و تحت پیشبر AOX1 به پیکیا پاستوریس به روش الکتروپوریشن ترنسفرم و در ژنوم میزبان ادغام شد. به منظور تعیین شرایط بهینه بیشینه بیان آنزیم، در سطوح مختلفی از دما، غلظت مس و متانول القای بیان صورت گرفت و فعالیت آنزیم در هریک از سطوح مورد ارزیابی قرار گرفت. بیشینه ی بیان آنزیم در غلظت 0.4 میلی مولار مس و 0.8 درصد متانول و دمای 25 درجه سانتی گراد به دست آمد. بیشینه ی بیان ترشحی لاکاز در شرایط بهینه 9600 U/L به دست آمد. پس از بررسی کیفی و کمی آنزیم برخی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم تعیین شد. دما و pH بهینه ی لاکاز نوترکیب به ترتیب40  درجه سانتی گراد و 3 تعیین شد. بررسی پایداری دمایی و pH لاکاز نشان داد که این آنزیم پایداری بالایی در برابر حرارت داشته و قادر به فعالیت در طیف وسیعی از pH می باشد.  بررسی خصوصیات کینتیکی آنزیم با استفاده از سوبسترای ABTS، Km=0.089 mM تعیین شد. نتایج این تحقیق نشان داد که پیکیا پاستوریس می تواند کاندیدای مناسبی برای بیان لاکاز نوترکیب به منظور استفاده در صنایع متعدد جهت پاکسازی پساب، بیوسنسور و سایر کاربردها باشد.