تکثیر و همسانه سازی ژن سه قسمتی lsc در وکتور pcDNA3.1 و بررسی بیان آن در لاین سلولی

اسهال دومین عامل رایج مرگ و میر کودکان زیر 5 سال است. مهم ترین سویه های بیماری زایی اشریشیاکلی انتروتوکسیژنیک با تولید سم Lt و St موجب بیماری اسهال مسافران و اشریشیاکلی انتروهموراژیک با ترشح سم شبه شیگا موجب اسهال خونی می شود. زیرواحد B انتروتوکسین کلره در باکتری ویبریوکلرا در ایجاد بیماری اسهال نقش به سزایی دارد.به احتمال با ترکیب اپی-توپ های CtxB، LtB و StB (LSC) و تولید واکسن تری والان می توان آنتی بادی اختصاصی تری برای مقابله با این سموم ایجاد کرد. هدف از این تحقیق تکثیر ژن کایمر lsc جهت کلونینگ در وکتور pcDNA3.1(+) به منظور طراحی DNA واکسن و بررسی بیان در وکتور یوکاریوتیک است.

توالی ژن lsc پس از طراحی پرایمر و تکثیر به وسیله PCR به وکتورpcDNA3.1(+) منتقل شد. وکتور pcDNA3.1(+) و محصول PCR با استفاده از آنزیم HindIII و EcoRI مورد هضم قرار گرفت. کلونینگ ژن lsc در وکتورpcDNA3.1(+) و PCR انجام شد. کلون ها مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. جهت اطمینان از بیان ژن lsc به سلول HEK-293T منتقل و با استفاده از روش وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.

ژن lsc پس از PCR و کلونینگ در وکتورpcDNA3.1(+) با استفاده از هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفت و قطعه ای به طول  bp933 رویت و تایید شد. سپس با استفاده از کیت توربوفکت به سلول HEK-293T منتقل و بیان پروتئین نوترکیب به روش وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت و پروتئین به وزن 39 کیلودالتون تایید شد.

نتایج به دست آمده از ژن کایمر به خوبی در لاین سلولی بیان و توسط وسترن بلاتینگ تایید شد که می تواند کاندید مناسبی برای مقابله با عفونت باکتریایی باشد.