بیان موقت و خالص سازی پروتئین پروکیموزین در گیاه توتون با استفاده از وکتور ویروسی

هدف از این تحقیق همسانه سازی و بیان پروتیین نوترکیب کیموزین و پروکیموزین در گیاه توتون با استفاده از ناقل ویروس موزاییک تنباکو و خالص سازی پروتیین تولید شده بود.

 توالی پروکیموزین بزی از پایگاه داده NCBI دریافت و براساس ترجیح کدونی گیاه توتون بهینه سازی گردید. سپس با طراحی آغازگرهای مختلف ژن پروکیموزین و کیموزین تکثیر و در ناقل های دوتایی (باینری) و ویروسی همسانه سازی و به باکتری آگروباکتریوم تومه فاشینس انتقال داده شد. با روش آگرواینفیلتراسیون باکتری حامل ناقل های دوتایی و ویروسی به برگ های گیاه توتون تزریق گردید. روش وسترن بلاتینگ به منظور بررسی بیان پروتیین مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت نسبی پروتیین ها در تشکیل لخته مورد بررسی قرار گرفت. 

زمانی که ژن پروکیموزین با استفاده از ناقل های دوتایی در گیاه توتون بیان گردید، فقط یک باند ضعیف در پروتیین کل استخراج شده مشاهده گردید، ولی زمانی که ژن کیموزین در ناقل دوتایی بیان گردید، در پروتیین محلول نیز باند مشاهده گردید. استفاده از ناقل های ویروسی باعث نکروزه شدن برگ های گیاه توتون گردید و نتایج مشابهی نیز با ناقل های دوتایی بدست آمد به طوری که زمانی که ژن پروکیموزین بیان گردید فقط یک باند در پروتیین کل، ولی زمانی که کیموزین بیان گردید علاوه بر پروتیین کل در پروتیین محلول استخراج شده نیز باند مشاهده گردید. بیشترین میزان بیان با استفاده از سازه ژنی TMVαchymosinhyFC بدست آمد که پروتیین خالص شده دارای فعالیت تشکیل لخته U 8/16 در هر گرم برگ تر بود.

اگرچه استفاده از ناقل های ویروسی و بیان موقت می تواند روش ارزان، سریع و موثری برای تولید پروتیین های نوترکیب باشد ولی در تحقیق حاضر نکروزه شدن و مشکلات احتمالی گیاه توتون با کل یا بخشی از ژن پروکیموزین باعث کاهش سطح بیان کیموزین گردید، که تعیین دلایل احتمالی و راه های رفع آن ها  نیازمند مطالعات بیشتر می باشد.