طراحی سازه ژنی فیتاز ایکولای و فیتاز آسپرژیلوس نایجر و بیان آن در مخمر پیکیا پاستوریس به منظور افزایش تجزیه فیتات گیاهی

فیتازها براساس اولین کربنی که در حلقه میواینوزیتول فسفات در فیتات دفسفریلاسیون شروع می شود به گروه های 3-فیتازها (E.C. 3.1.3.8) ، 6- فیتازها (E.C. 3.1.3.26) و 5- فیتازها (EC 3.1.3.72) طبقه بندی می شوند مخمرها با داشتن ویژگی های زیادی ازجمله دستکاری ژنتیکی آسان، بیان بالای پروتئین های برون سلولی و درون سلولی و توانایی انجام اصلاحات پس ازترجمه ای متناسب با سلول های یوکاریوتی، برای بیان پروتئین های خارجی مناسب هستند. مخمر متانول دوست پیکیا پاستوریس برای تولید پروتئین های نوترکیب در تراکم سلولی بالا و محیط کشت ارزان، توسعه یافته است. بنابراین بیان همزمان دو آنزیم دریک میزبان بیانی نوترکیب سودمند خواهد بود. هدف ازاین مطالعه ساخت وکتور نوترکیب حاوی ژن های فیتاز ایکولای از خانواده 6-فیتاز و فیتاز آسپرژیلوس نایجر از خانواده 3-فیتاز به منظور افزایش تجزیه فیتات و بیان همزمان آنها در مخمر پیکیا پاستوریس بود.

توالی نوکلئوتیدی ژن های آنزیم فیتاز ایکولای ، (appA2) فیتاز آسپرژیلوس نایجر ، (phyA) لینکر 2a و سیگنال پپتید آلفا فاکتور از پایگاه داده NCBI دریافت گردید. در این پژوهش ژن های فیتاز ایکولای و آسپرژیلوس نایجر که بوسیله لینکر 2a بهم متصل شده بودند در پلاسمید PIC9K طراحی و برای سنتز به شرکت Genescript آمریکا فرستاده شد. پس از دریافت پلاسمید سنتز شده که حاوی ژن های مورد نظر بود این سازه ژنی در باکتری DH5a کلون شد و پس از برش با آنزیم SacI در مخمر پیکیا پاستوریس الکتروترنسفرم شد. تحریک بیان ژن با استفاده از متانول در غلظت نهایی نیم درصد در دمای 30 درجه سانتیگراد صورت گرفت. نمونه گیری هر24 ساعت انجام شد و میزان تولید پروتئین نوترکیب بااستفاده از الکتروفورز بررسی گردید.

نتایج حاصل از کلونی PCR نشان داد که وکتور مورد نظر با موفقیت در باکتری DH5a ترانسفرم شده است و نتایج حاصل از PCR نشان داد که پلاسمید با موفقیت وارد مخمر شده است. فیتازappA و فیتاز phyA با موفقیت در مخمر پیکیا پاستوریس بیان شد. وزن مولکولی فیتازهای نوترکیب تولید شده در حدود 45 و 80 کیلو دالتون به ترتیب برای فیتاز appA و فیتاز phyA تخمین زده شد. فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شدهU/ml 160.97 بود.

به منظور تولید مکمل آنزیم فیتاز نوترکیب، ژن های هدف دروکتور بیانی pPIC9k طراحی و سنتز شد و وکتور نوترکیب پس از تکثیر در باکتری اشرشیا کلیDH5α وارد ژنوم مخمر پیکیا پاستوریس به عنوان میزبان بیانی شد. این سازه ژنی برای انجام آزمایشات بعدی (آزمایشات مزرعه ای) استفاده خواهد شد.