همسانه سازی ژن ddh از Corynebacterium glutamicum در راستای افزایش تولید اسیدآمینه لیزین

L لیزین یکی از اسیدهای آمینه ضروری است که به دلیل کاربرد بسیار در صنایع مختلف، در سال های اخیر تقاضا برای این اسید آمینه افزایش یافته و این منجر به گسترش تحقیقات برای تولید صنعتی این اسیدآمینه شده است.

در این پژوهش با بهینه سازی ژنتیکی سعی در افزایش بازده تولید این اسیدآمینه شد. پس از بررسی آنزیم های تاثیرگذار در مسیر بیوسنتز لیزین، ژن ddh کدکننده آنزیم دی آمینوپیملات دهیدروژناز انتخاب شد. پس از استخراج DNA کروموزومی سویه Corynebacterium glutamicum ATCC 21799 و طراحی پرایمر، قطعه ژنی جدا شده و به منظور تسهیل همسانه-سازی و تعیین ترادف نوکلئوتیدی در وکتور TAcloning کلون گردید. هضم آنزیمی دو وکتور TAcloning و pET28a توسط آنزیم های برشی SalI و EcoRI انجام و پس از تیمار وکتور با آلکالین فسفاتاز، واکنش لیگاسیون صورت گرفت. سپس در سوش E.coliDH5α و در نهایت در میزبان بیانی E.coliBL21(DE3) ترانسفورم شد.

مشاهده باند bp1150 در نمونه های PCR و محصول پلاسمید تخلیص شده و هضم شده با دو آنزیم مذکور و همچنین نتیجه تعیین توالی نشان داد که ژن مورد نظر به درستی کلون گردیده است. بررسی میزان بیان پروتئین نوترکیب توسط ژل SDS-Page تاییدی دیگر بر صحت کلون سازی و فعالیت پروموتور می باشد.

در این تحقیق برای اولین بار میزان بیان آنزیم دی آمینوپیملات دهیدروژناز در این وکتور بیانی افزایش قابل قبولی را نشان داد.