ایجاد جهش نقطه ای در اسید آمینه 263 ژن استرپتوکیناز و کلونینگ و بیان پروتئین جهش یافته حاوی سیستئین

استرپتوکیناز یکی از شناخته شده ترین عوامل ترومبولیتیک با مصرف بالینی گسترده است. با وجود این، کاربرد آن به دلیل ایمونوژن بودن، ایجاد عوارض هموراژیک و نیمه عمر نسبتا کوتاه، همراه با خطرهایی است. پگیلاسیون اختصاصی بر روی اسیدآمینه سیستئین، تکنیکی مفید جهت کاهش بسیاری از این عوارض است. هدف از مطالعه حاضر، طراحی و تولید مولکول استرپتوکیناز جهش یافته حاوی سیستئین است که برای پگیلاسیون اختصاصی قابل استفاده باشد. اسیدگلوتامیک 263 استرپتوکیناز، که یک اسیدآمینه سطحی در ساختار پروتئین استرپتوکیناز است، برای انجام جهش و تعویض با سیستئین انتخاب شد. برای نیل به این هدف، با به کارگیری روش SOEing PCR، جهش بر روی کدون GLU263 ژن استرپتوکیناز برای تبدیل به کدون سیستئین انجام شد. سپس، ژن استرپتوکیناز دست نخورده و جهش یافته در وکتور بیانی pET-26b (+) وارد شدند. ساختارهای حاصل درون اشریشیا کلی Rosetta (DE3) ترنسفرم شده و توسط القا با IPTG بیان شدند. درنهایت، تولید پروتئین ها به وسیله آزمون های SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ تایید شد. پروتئین ها به وسیله افینیتی کروماتوگرافی با ستون Ni-NTA agarose در شرایط دناتوره با اوره تخلیص شدند و برای حذف اوره و تاخوردگی مجدد پروتئین ها از فیلتراسیون ژلی با سفادکس G-25استفاده شد. نتایج این مطالعه نشان داد که با استفاده از وکتور و میزبان مذکور ژن جهش یافته حاوی کدون سیستئین به خوبی بیان می شود و برای پگیلاسیون اختصاصی مناسب خواهد بود.