طراحی تلفیق ژنی پلی اولئوزین-پروانسولین و انتقال آن به گیاه کلزا (Brassica napus L.)

استفاده از ژن اولئوزین گیاهی یک روش مناسب برای تولید و تجمع پروتئین نوترکیب در مقیاس زیاد و همچنین استخراج راحت تر و ارزان تر می باشد. اتصال اولئوزین به ژن موردنظر، موجب هدف گیری پروتئین نوترکیب به اجسام روغنی بذر می شود. در سال های اخیر، به منظور افزایش کارایی اولئوزین در تولید پروتئین نوترکیب، چند ژن اولئوزین (پلی اولئوزین) ، به ژن هدف متصل می شود. این امر سبب تولید و تجمع پروتئین نوترکیب در سطوح اقتصادی در بذر می گردد. از این رو برای افزایش میزان تجمع پروتئین پروانسولین در بذر گیاه کلزا، یک سازه ی تلفیقی پلی اولئوزین-پروانسولین طراحی و ساخته شد. در طراحی این توالی به ترتیب از سمت /5 توالی، یک توالی کزاک، یک برچسب هیستیدین، سه ژن اولئوزین، یک جایگاه پروتئولیتیکی برای پروتئاز، ژن پروانسولین و یک کدون پایان تترانوکلئوتید قرار گرفت. این تلفیق ژنی پس از سنتز در ناقل pUC57 قرار داده شد. تلفیق ژنی، پس از هضم آنزیمی به وسیله ی آنزیم های BamHI و SacI از pUC57 جداسازی و در ناقل دوتایی pBI121 همسانه سازی گردید. پس از تائید درج تلفیق ژنی در ناقل pBI121 با استفاده از روش های PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی، ناقل نوترکیب به سویه ی LBA4404 اگروباکتریوم انتقال داده شد. این باکتری برای تراریختی ریزنمونه های کوتیلدون و هیپوکوتیل کلزا مورد استفاد قرار گرفت. نوساقه های باززایی شده در محیط انتخابی حاوی کانامایسین گزینش شدند. آنالیز گیاهان تراریخته در سطح DNA با استفاده از روش PCR انجام و یک قطعه ی 120 جفت بازی (مطابق با بخشی از ژن پروانسولین) تکثیر شد. همچنین تکثیر این قطعه ی 120جفت بازی با روش RT-PCR، بیانگر بیان ژن هدف در گیاهان تراریخته بود.