کشت سلول های اندوتلیال قرنیه انسانی در محیط آزمایشگاه با استفاده از مایع آمنیوتیک انسانی

ارزیابی اثر مایع آمنیوتیک انسانی (Human Amniotic Fluid; HAF) بر روی رشد سلول های اندوتلیال قرنیه انسانی (Human Corneal Endothelial Cells; HCECS) و هم چنین تعریف محیط کشت برای رشد این سلول ها.
روش پژوهش: سلول های آندوتلیوم در محیط 12DMEM-F که با سرم جنین گاوی 20 درصد غنی شده بود کشت داده شدند. پس از اشباع محیط کشت، سلول ها مورد درمان با تریپسین قرار گرفته و به محیط کشت حاوی سرم جنین گاوی 20 درصد و مایع آمنیوتیک انسانی 10، 20 و 30 درصد منتقل شدند. HAF از زنان باردار در سه ماهه اول بارداری گرفته شد. جهت ارزیابی اثر HAF بر روی رشد و توانایی زیستی سلول، از روش ELISA برای بررسی تکثیر و مرگ سلولی استفاده شد. ماهیت سلول های کشت داده شده در محیط حاوی مایع آمنیوتیک 20 درصد با استفاده از روش های ایمونوسیتوشیمی و Real time PCR جهت نشانگرهای ویژه HCECs شامل 67Ki-، Vimentin، Na/K-ATPase، و 1ZO- بررسی شد.
کشت های اولیه در محیط حاوی مایع آمنیوتیک منجر به رشد و تکثیر سلول های آندوتلیوم در 8/95 درصد موارد گردید. Real time PCR و ایمونوسیتوشیمی نشان داد که نشانگرهای Na/K-ATPase و 1ZO- که ویژه HCECs می باشند در سلول های کشت شده در محیط حاوی مایع آمنیوتیک 20 درصد، بیش تر از محیط شاهد (حاوی سرم جنین گاوی) بیان می شود. آزمایش ایمونوسیتوشیمی روی سلول های اندوتلیال کشت داده شده با HAF 20 درصد، افزایش بیش تری را در بیان نشانگرهای مذکور در مقایسه با محیط های حاوی غلظت های 10 درصد و 30 درصد HAF نشان داد. تعداد سلول های اندوتلیال کشت داده شده در HAF 20 درصد که نشانگرها را بروز می دادند برای شاخص های Vimentin، 1-ZO، Na/K-ATPase به ترتیب 98 درصد، 95 درصد، و 100 درصد بود. بیش از 80 درصد سلول ها، 67-Ki را بروز می دادند که نشان می دهد سلول ها ظرفیت تکثیر خود را حفظ کرده اند. میزان افزایش شاخص های Vimentin، 1-ZO، Na/K-ATPase به ترتیب 5 برابر (003/0P=)، 5/3 برابر (001/0P=) و 3 برابر (03/0P=) در محیط حاوی HAF 20 درصد در مقایسه با محیط شاهد بود. Real time PCR افزایش 400 برابری (008/0P=) در بیان ژن Na/K-ATPase و افزایش 500 برابری (01/0P=) در بیان ژن 1-ZO در محیط حاوی HAF 20 درصد در مقایسه با محیط شاهد نشان داد.
محیط حاوی HAF 20 درصد به طور مشخصی باعث افزایش توانایی تکثیر سلول های آندوتلیال قرنیه انسان می شود ولی مشخصات مورفولوژی و آنتی ژنیک آن ها را حفظ می نماید. بنابراین HAF می تواند به عنوان یک مکمل غنی در مطالعات تکثیر HCECs در نظر گرفته شود.