کلونینگ، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب فیوژن Tat-Nef ویروس HIV-1 در سیستم بیانی پروکاریوتی

ویروس HIV-1 یک لنتی ویروس و عامل بیماری ایدز میباشد که امروزه به عنوان معضل بهداشت جهانی مطرح است. یکی از پروتئینهای مهم ویروس به نام Nef نقش مهمی در چرخه تکثیر ویروس و پیشرفت بیماری ایدز دارد و القای پاسخ ایمنی بر ضد آن می تواند تا حدی عفونت ویروسی را مهار نماید؛ بنابراین، این پروتئین میتواند کاندید مناسبی برای تهیه واکسن ضد ویروس HIV باشد. بعلاوه، بخشی از ناحیه پروتئین فعال کننده رونویسی (Tat، اسید آمینه های 48 تا 60) از ویروس HIV توانسته است به عنوان یک پپتید نفوذ کننده سلولی (CPP) عمل نماید. در این تحقیق، با توجه به نقشهای مهم این دو پروتئین به ویژه در طراحی واکسن، برای اولین بار کلونینگ و بیان فیوژن Tat-Nef در باکتری اشریشیاکلی صورت گرفت. تایید بیان پروتئین توسط آنالیز وسترن بلات و تخلیص آن توسط روش رنگ آمیزی معکوس انجام شد.
در این مطالعه تجربی، تکثیر فیوژن Tat-Nef با پرایمرهای اختصاصی توسط تکنیک PCR انجام شد. پس از هضم آنزیمی محصول PCR با آنزیم های Not I و EcoRI، الحاق ژن در وکتور خطی شده pGEX6p2 صورت گرفت. پس از ترنسفورماسیون باکتری E.coliسویه BL21 (DE3) با پلاسمید نوترکیب pGEX-Tat-Nef، و تایید کلونهای نوترکیب با استفاده از روش هضم آنزیمی و آنالیز PCR، القای بیان پروتئین نوترکیب توسط القا کننده IPTG انجام شد. تایید بیان توسط تکنیک SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی منوکلونال ضد Nef صورت گرفت. سپس، تخلیص پروتئین فیوژن توسط تکنیک رنگ آمیزی معکوس از روی ژل انجام شد.
نتایج آنالیز PCR و هضم آنزیمی، وجود باند واضح حدود 726 جفت باز را روی ژل آگارز تایید کرد که نشانگر کلونینگ صحیح فیوژن Tat-Nef در وکتور بیان پروکاریوتی pGEX6p2 بود. همچنین، وجود باند پروتئینی حدود 54 کیلودالتون روی ژل SDS-PAGE نشانگر بیان پروتئین Tat-Nef تحت القای آنتی رپرسور IPTG می باشد که توسط آنتی بادی منوکلونال ضد Nef در آنالیز وسترن بلات تایید شد. نهایتا، باند خالص شده پروتئین توسط تکنیک رنگ آمیزی معکوس به دست آورده شد.
پروتئین فیوژن نوترکیبTat-Nef در میزبان E.coli با مقدار مناسب بیان و تخلیص شد. پروتئین مورد نظر به عنوان یک آنتی ژن برای طراحی واکسن پروتئینی در مقابل عفونت ویروس HIV استفاده خواهد شد.