کلونینگ و بیان آنزیم درمانی اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس در اشریشیاکلی

اوریکاز (EC 1.7.3.3) آنزیمی است که باعث کاتالیز اوریک اسید به H2O2 و الانتوئین می شود و در درمان نقرس استفاده می شود. هدف این تحقیق کلون سازی ژن سنتتیک کدکننده ی آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاوس در پلاسمید pET-28a(+) و بیان نوترکیب آن در اشریشیاکلی می باشد.
بعد از استخراج توالی ژنی از پایگاه داده ها، ژن کدکننده ی اوریکاز بهینه سازی شد و سنتز آن سفارش داده شد. سپس ژن سنتتیک در پلاسمید pET-28a(+) در بین آنزیم های NcoI و XhoI ساب-کلون شد و توسط روش های هضم آنزیمی، PCR و تعیین توالی کلون سازی صحیح آن تایید شد. بعد از انتقال آن به باکتری Bl21 به روش شیمیایی والقا آن توسط IPTG، بیان آن بهینه سازی شد. برای ارزیابی القا آنزیم نوترکیب، ژل الکتروفورز پروتئین استفاده شد.
نتایج حاصل از هضم آنزیمی، PCR و تعیین توالی نشان داد که آنزیم اوریکاز به طور صحیح در جایگاه مورد نظر کلون سازی شده است. دمای 22 درجه ی سانتی گراد و زمان 6 ساعت با غلظت IPTG 1 میلی مول برای بهینه سازی بیان آنزیم به دست آمد. نتایج الکتروفورز آنزیم نوترکیب، جرم مولکولی 5/34 کیلودالتون را برای آنزیم بیان شده نشان داد. تعیین فعالیت آنزیمی مشخص کرد که فعالیت ویژه ی آنزیم اوریکاز 69/7 واحد بر میلی گرم است و آنزیم به لحاظ عملکردی فعال است.
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که ژن اوریکاز را می توان به آسانی در سیستم بیانی pET کلون و بیان کرد. نتایج تعیین فعالیت ویژه مشخص کرد که پروتئین آنزیمی به صورت محلول در سیتوزول اشریشیا کلی تولید شده است و از نظر کاتالیتیکی فعال است.