تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب حاوی تگ تمایلی به هیدروکسی آپاتیت با کمک ستون کروماتوگرافی سرامیکی

امروزه ترمیم بافت استخوانی با افزایش اختلالات و آسیب های استخوانی از اهمیت خاصی برخوردار است. مهندسی بافت استخوان، راهکارهای ویژه ای را برای رفع این مشکلات فراهم کرده است. مطالعه حاضر با هدف تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب حاوی تگ تمایلی به هیدروکسی آپاتیت با کمک ستون کروماتوگرافی سرامیکی انجام شد.

 در مطالعه حاضر، نوعی پپتید فیوژن طراحی شد که از یک سو حاوی توالی دمین اتصالی به هپارین بود که می تواند به انواع مختلفی از فاکتورهای رشد دخیل در ترمیم بافت متصل و باعث به دام انداختن این فاکتورها در محل ضایعه شود و از سوی دیگر حاوی یک تگ بود که شامل توالی به دست آمده از یک مطالعه آزمایشگاهی مبتنی بر بیان فاژی است. علت قراردادن این تگ، اتصال پپتید به داربست حاوی هیدروکسی آپاتیت و تخلیص پپتید نوترکیب توسط ستون هیدروکسی آپاتیت بود. بنابراین توالی ژن برای بیان در میزبان پروکاریوتی E. coli سویه BL21 بهینه سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم های SacI و BamHI در وکتور بیانی pET-21a(+) ساب کلون شد. بیان پپتید نوترکیب از طریق روش های SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی شد. برای بهینه کردن شرایط تخلیص، با اعمال تغییرات اساسی در روش کار اصلی شرکت سازنده، تخلیص دو مرحله ای انجام شد. این پپتید با تمایل بالایی به ستون متصل و با خلوص قابل قبولی تخلیص شد. در نهایت وجود تجمعات پپتیدی از طریق روش DLS بررسی شد.

نتایج کلونی PCR، هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم های SacI و BamHI و تعیین توالی حاکی از صحت فرآیند کلونینگ بود. از طرفی بیان پپتید فیوژن توسط روش های SDS-PAGE و وسترن بلات تایید و مهاجرت آن روی ژل باعث ظاهرشدن باندی در حدود 12کیلودالتون شد. تغییرات ایجادشده در روش کار شرکت سازنده باعث شد فرآیند تخلیص به صورت مطلوبی انجام شود و در نهایت نتایج روش DLS هم خلوص پپتید تخلیص شده را نشان داد.

 نتایج نشان دهنده بیان مطلوب و خلوص قابل توجه پپتید فیوژن طراحی شده در این مطالعه است.