بهینه سازی تولید آمیلاز در باکتری همزیست با اسفنج های دریایی

آنزیم ها پروتیین هایی هستند که به طور انتخابی تمام واکنش های متابولیک را در موجودات زنده کاتالیز می کنند. میلیو ن ها آنزیم توسط پروکاریوت ها و یوکاریوت ها تولید می شوند. اسفنج های دریایی با ارگانیسم های مختلفی مانند باکتری ها، قارچ ها، ویروس ها، پروتوزوآها و موجودات تک سلولی بنام جلبک ها همزیستی دارند و طبیعت میان کنش اسفنج ها با میکروب ها بسیار متنوع است.حدود 40 درصد از حجم توده اسفنج از باکتری های همزیست تشکیل شده است. حداقل 32 شاخه باکتریایی در اسفنج های دریایی شناخته شده است که توسط روش های وابسته به کشت و مستقل از کشت جداسازی شده اند. میکروارگانیسم های همزیست با اسفنج ها منبع ترکیبات مختلفی هستند که در گذشته گمان می رفت توسط اسفنج ها تولید می شوند که اکنون مشخص شده که توسط این میکروارگانیسم های همزیست مشتق شده اند. چنانچه باکتری های تولیدکننده این ترکیبات جداسازی شوند می توان جهت تولید انبوه آنها را کشت داد. هدف از این تحقیق جداسازی باکتری ه ای تولیدکننده آنزیم آمیلاز از اسفنج های دریایی و بهینه سازی شرایط رشد و تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر می باشد. باکتری های همزیست با اسفنج با استفاده از روش رقیق سازی سریالی و آنالیز های افتراقی در باکتری های جداشده انجام شد. فعال ترین ایزوله با استفاده از روش های کیفی و کمی هیدرولیز نشاسته انتخاب شد.

ویژگی های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی با استفاده از کتاب برجی و سیستماتیک باکتری ها انجام شد. آنالیز های افتراقی با انجام تست های کاتالاز، گرم، TSI، سیمون سیترات، اورنیتیل دکربوکسیلاز، لیزین دکربوکسیلاز، VP، MR، ایندول و SIM انجام شد. غربالگری اولیه جهت جداسازی ایزوله های تولیدکننده آنزیم آمیلاز به ترتیب، با انجام آزمایش های پلیت حاوی نشاسته و دی نیتروسالیسیلیک اسید (DNS) صورت گرفت. جهت بهینه سازی تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر (SS1) با استفاده از محیط کشت M1 حاوی غلظت های مختلف NaCl (2 تا 14 درصد)انجام شد. برای یافتن pH بهینه از محیط کشت M1 با pH های مختلف 4تا 8 استفاده شد و پس ازگذشت زمان انکوباسیون فعالیت آمیلازی آن ها مورد آزمایش قرار گرفت. ایزوله SS1 در محیط کشت M1 در 28 درجه سانتیگراد به مدت 7 روز جهت تهیه توده سلولی مناسب برای استخراج DNA کشت داده شد. استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA از باکتری های گرم مثبت، انجام شد. تکثیر ژن 16S rRNA با استفاده از DNA استخراج شده و آغازگرهای F27  و R1492 انجام شد. محصول PCR به دست آمده توالی یابی شده و توالی ها مورد بررسی قرار گرفت. توالی ژن 16S rRNA به دست آمده با استفاده از نرم افزار BLAST موجود در داده پایگاه ژنی NCBI همردیف شد و در سطح جنس با استفاده از نرم افزار CLUSTAL-X شناسایی شد. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار MEGA 6.06 و روش Neighbor-Joining رسم گردید. صحت درخت فیلوژنی با بوت استرپ 1000 تکرار صورت گرفت.

آنالیزهای بیوشیمیایی نشان داد که هر سه ایزوله کاتالاز و گرم مثبت هستند و هیچکدام H2S تولید نمی کنند. تمام ایزوله ها برای آزمایش های TSI، MR و VP منفی بودند. توالی های 16S rRNA بدست آمده از فعالترین ایزوله تولیدکننده آنزیم آمیلاز نشان می دهد که این ایزوله متعلق به جنس باسیلوس می باشد. شرایط بهینه رشد و تولید آنزیم آمیلاز در ایزوله برتر به شرح زیر می باشد: غلظت 12 درصد NaCl، دمای 35 درجه سانتی گراد و pH 12 می باشد. بیشترین فعالیت آمیلازی مشاهده شده در شرایط بهینه رشد ایزوله برتر مورد مطالعه 109 واحد آنزیمی بود (هر واحد آنزیمی عبارتست از میزان آنزیمی که یک میکروگرم گلوکز را در یک دقیقه آزاد کند).

نتایج نشان می دهند که تولید آنزیم به شرایط رشد باکتری بستگی دارد و در مطالعات بعدی لازم است ژن کدکننده آنزیم آمیلاز تکثیر و جهت تولید انبوه آنزیم در میزبان مناسب کلون شود.