استخراج و بهینه سازی تخلیص چند مرحله ای آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین ACE)I) از ریه خرگوش

آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین (ACE) I یک پپتیدیل دی پپتید هیدرولاز است که 2 اسید آمینه انتهای کربوکسیلی(His-Leu) را از آنژیوتانسین I که یک دکاپپتید است جدا کرده و آنژیوتانسین II(یک اکتاپپتید) را تولید می نماید. به علت اهمیت ACE و مهارکننده های آن در بیماری زایی و درمان بیماری های قلبی عروقی مانند فشار خون بالا و نارسایی قلبی، تخلیص و سنجش آن علاوه بر ارزش علمی دارای اهمیت بالینی و تجاری می باشد. با توجه به این مطلب، در مطالعه حاضر ACE از بافت ریه خرگوش به عنوان منبع غنی از ACE در 3 مرحله خالص گردید. برای استخراجACE، پس از عمل هموژن کردن، از دترژنت غیریونی Nonidet-P40 استفاده شد سپس محلول استخراج شده از دترژنت، تحت عمل رسوب دهی با سولفات آمونیوم با غلظت های اشباعی 50% و 70% قرار گرفت. در مرحله بعد محلول رویی به دست آمده توسط تبادل یونی با Q-Sepharose HP کروماتوگرافی شد سپس نمونه های دارای حداکثر فعالیت مخصوص آنزیم، توسط Sepharryl HR S200 تحت کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون قرار گرفتند. پس از این مرحله خالص بودن آنزیم با SDS-PAGE و PAGE تایید شد و وزن مولکولی آن 175 کیلودالتون تعیین گردید. فعالیت مخصوص نهایی به دست آمده برای ACE،39.1 واحد در میلی گرم بود که به دنبال 651 برابر خالص کردن حاصل شده بود و بازده نهایی فرآیند تخلیص، 2/5% مشاهده شد. پس از تخلیص آنزیم، (michaelis constant) Km آن برای سوبسترای HHL (هیپوریل هیستیدیل لوسین)، 17/2 میلی مول محاسبه شد. مهار کننده رقابتی کاپتوپریل توانست در غلظت های 1/0 تا 001/0 میلی مولار تقریبا ACE را به طور کامل مهار کند.PH اپتیمم برای 8.3 ACE محاسبه گردید. هم چنین بررسی اثر تغییرات دمایی، کاهش شدید در فعالیت آنزیم را در دمای بالاتر از 37 درجه سانتی گراد نشان داد. کاهش مراحل تخلیص و مدت زمان لازم برای آن و نیز بازده مناسب به دست آمده، نتیجه استفاده از رزین های با قدرت تفکیک بهتر و به کارگیری سیستم (Fast Protein Liquid Chromatography) FPLC بود که در نهایت موجب بهبود و کاهش زمان فرآیند تخلیص چند مرحله ایACE گردید.