بررسی افزایش تولید مشتقات فنلی دارویی گیاه کلپوره (.Teucrium polium L) با استفاده از تازن کیتوسان در شرایط In vitro

کلپوره (.Teucrium polium L)، گیاهی علفی از تیره نعناع است که مصارف دارویی فراوانی در طب سنتی دارد. در سال های اخیر اثرهای دارویی متعدد مانند ضددیابت، ضدسرطان، ضداسپاسم، کاهش دهنده چربی و فشار خون آن گزارش شده است. بنابراین کشت این گیاه در شرایط آزمایشگاهی برای حفظ بقاء، تکثیر و افزایش متابولیت های ثانویه این گونه ضروریست. از راهکارهای اساسی، استفاده از تازن ها در تکنیک کشت بافت گیاهی یکی از پرکاربردترین روش ها برای افزایش متابولیت های ثانوی-دارویی است. کیتوسان بیوپلیمری است که سبب القای پاسخ های دفاعی، افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان و مسیر فنیل پروپانویید و تجمع ترکیبات فنلی می شود. در این پژوهش با هدف بهینه سازی تولید متابولیت های ثانوی و افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی، اثر تازن زیستی کیتوسان بر برخی ترکیبات فنلی گیاه کلپوره در شرایط کشت در شیشه مطالعه شد. به این منظور ریزنمونه برگ از گیاه کلپوره نگهداری شده در شرایط هیدروپونیک و تغذیه شده با محلول هوگلند، تهیه شد و بعد از سترون کردن با سدیم هیپوکلرید 5% (v/v) و اتانول 70% (v/v)، برش های میانی از ریزنمونه برگ تهیه گردید و در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی غلظت های مجزا و تلفیقی هورمون های بنزیل آمینو پورین (BAP) (1 و 1.5 میلی گرم در لیتر) و نفتالن استیک اسید (NAA) (0.5 میلی گرم در لیتر) قرار داده شد. نمونه ها به مدت چهار هفته در شرایط تاریکی و دمای 25 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. با ظهور نشانه های کال زایی، نمونه ها به شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند و در پایان هفته ششم، عملیات واکشت پینه های القاء شده انجام شد. پینه ها با غلظت های مختلف (صفر، 50، 100 و 150 میلی گرم در لیتر) تازن زیستی کیتوسان تیمار شدند. پس از گذشت 8 هفته از رشد پینه ها، پینه های سبز جمع آوری و در فریزر منفی 20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. به منظور تهیه عصاره نهایی برای سنجش های بیوشیمیایی، عصاره گیری از پینه های سبز انجام شد و از این عصاره برای اندازه گیری مقادیر ترکیبات فنلی (فنل، فلاونویید، فلاون و اسیدهای فنلی) و فعالیت آنتی اکسیدانی به روش فعالیت جاروب کنندگی رادیکال آزاد DPPH و سنجش قدرت کاهشی  FRAP و سنجش میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) استفاده شد. نتایج حاصل از تجزیه وتحلیل داده ها نشان داد که کاربرد کیتوسان در چهار غلظت (صفر، 50، 100 و 150 میلی گرم در لیتر) و تمامی تیمارهای هورمونی (BAP1, BAP1.5, BAP1.5+NAA0.5میلی گرم در لیتر)، سبب تاثیر افزایشی معنی دار در محتوی ترکیبات فنلی و ظرفیت آنتی اکسیدانی و فعالیت آنزیم PAL نسبت به نمونه شاهد در پینه های سبز القاء شده کلپوره شد. به طوری که تیمار همزمان و تلفیقی هورمون BAP در غلظت 1.5 میلی گرم در لیتر به همراه هورمون NAA در غلظت 0.5 میلی گرم در لیتر به همراه تیمار 100 میلی گرم در لیتر تازن زیستی کیتوسان در پینه های سبز القاء شده کلپوره در کشت درشیشه، موجب بیشینه محتوی مشتقات فنلی (1884.95 برای فنل، 936.65 برای o-دی فنل، 1462.28 برای فلاونویید، 631.07 برای فلاون و 662.41 برای اسیدهای فنلی برحسب میلی گرم در 100 گرم وزن خشک) گردید. براساس تحلیل آماری داده ها و مقایسه میانگین داده ها مشخص شد که ظرفیت های آنتی اکسیدانی اندازه گیری شده برمبنای آزمون DPPH و FRAP، به ترتیب موجب افزایش 68.34 و 71.92 درصدی نسبت به نمونه شاهد شد. فعالیت آنزیم PAL نیز به طور قابل توجهی افزایش 65.81 درصدی را نسبت به نمونه شاهد در پینه های القاء شده کلپوره نشان داد. با توجه به اهمیت گیاه دارویی کلپوره، بکارگیری کیتوسان در نقش یک تازن زیستی موفق می تواند باعث افزایش سنتز متابولیت های ثانوی-مشتقات فنلی و به دنبال آن افزایش توان آنتی اکسیدانی و افزایش فعالیت آنزیم PAL در پینه کلپوره در شرایط in vitro گردد.