تنوع فنوتیپی و ژنوتیپی گونه های باسیلوس درون ‏رست در ریشه درختان ممرز (.Carpinus betulus L) در استان های مازندران و گلستان

باکتری های درون ‏رست به ویژه گونه های باسیلوس (Bacillus spp.)، به دلیل ویژگی های سودمند و ایمنی محیط زیستی به عنوان منبعی مهم برای افزایش رشد و مقاومت گیاهان در برابر تنش های زنده و غیرزنده استفاده می شوند. باتوجه به اینکه حفاظت از تنوع گیاهی و پایداری موجود در جنگل های هیرکانی، اهمیت ویژه ای در مدیریت این بوم سازگان حیاتی شمال کشور دارد، شناسایی و تعیین ویژگی های باکتری های مفید و ارزشمند با اثرات محافظت کنندگی در گیاهان این منطقه می تواند نقش مهمی در این زمینه داشته باشد. پژوهش پیش رو با هدف جداسازی، شناسایی و ارزیابی تنوع جدایه های باسیلوس درون‏ رست در ریشه درختان ممرز (Carpinus betulus L.) در جنگل های هیرکانی انجام شد.

جدایه های باسیلوس با روش نمونه برداری تصادفی از ریشه درختان ممرز در جنگل های استان های مازندران و گلستان جداسازی شدند. سوسپانسیون حاصل از ریشه های ضدعفونی سطحی و سپس خردشده در آب مقطر در محیط Tryptic soy agar کشت شد. تک کلونی ها براساس ویژگی های ریخت شناختی انتخاب و با واکشت خالص شدند. تعلق جدایه های به دست آمده برپایه ریخت شناسی کلونی، تولید اندوسپور، واکنش گرم و فعالیت اکسیداز و کاتالاز به جنس باسیلوس مشخص شد. ویژگی های فنوتیپی و نیز مولکولی جدایه ها با به کارگیری PCR با آغازگرهای IS50، BOX و REP تعیین شد. داده ها در صورت حضور با عدد یک و عدم حضور با عدد صفر با استفاده از نرم افزار TotalLab TL120 کدگذاری و ماتریس تشابه و درخت فیلوژنتیکی به ترتیب با استفاده از نرم افزار NTSYS 2.02e و الگوریتم UPGMA ترسیم شدند. یک نماینده از جدایه های هر گروه انتخاب شد. سپس، آن ها برای شناسایی مولکولی با به کارگیری آغازگرهای ناحیه S rDNA16 و ژن HSP60 با PCR تکثیر شدند. قطعه تکثیرشده پس از خالص سازی برای تعیین ترادف به شرکت Microsynth سوئیس ارسال شد. ترادف های به دست آمده با ترادف های موجود در ژن بانک NCBI به روش BLASTn مقایسه شد. درخت فیلوژنتیکی حاصل از مقایسه ترادف های نوکلئوتیدی جدایه ها با گونه های باسیلوس موجود در بانک ژن با استفاده از نرم افزار MEGA X و به کارگیری الگوریتم های درست نمایی بیشینه و اتصال همسایه با درجه اعتبار سنجی 1000 رسم شد. فعالیت ضدباکتریایی جدایه های باسیلوس با کاربرد عصاره دی کلرومتان و روش دیسک کاغذی برعلیه باکتری Brenneria roseae، عامل بیماری خیسی چوب درختان ممرز بررسی شد. توانایی جدایه ها در تولید زی لایه (بیوفیلم)، پروتئاز، سیانید هیدروژن و هورمون ایندول استیک اسید (IAA) نیز ارزیابی شد.

درمجموع، 30 جدایه باکتری از نمونه های تهیه شده از ریشه درختان ممرز جداسازی شد. هیچ کلونی باکتری در تشتک های شاهد مشاهده نشد که می تواند نمایانگر کارایی مطلوب روش ضدعفونی سازی سطحی به کاربرده شده و شاهدی بر درون‏رست بودن جدایه های به دست آمده محسوب شود. جدایه ها براساس ویژگی های فنوتیپی و ژنوتیپی در سه گروه مجزا قرار گرفتند. مقایسه ترادف ناحیه تکثیرشده از S rDNA16 و HSP60 با ترادف های موجود در ژن بانک NCBI و درخت فیلوژنتیکی ترسیمی نشان دهنده وجود گونه های Bacillus thuringiensis، B. subtilis و B. mycoides در نمونه ها بود. گونه B. thuringiensis بیشترین فراوانی و B. subtilis در رتبه بعدی و B. mycoides واجد کمترین فراوانی بودند. ترادف های حاصل از HSP60، تعیین دقیق موقعیت تاکسونومیکی جدایه های باسیلوس در سطح گونه را امکان پذیر کرد. سطح IAA تولیدی جدایه ها از هشت تا 75 میلی گرم در لیتر متغیر بود. جدایه های B. mycoides بیشترین و جدایه های B. subtilis کمترین سطح تولید را داشتند. اغلب جدایه ها قادر به تولید آنزیم های لیپاز، ژلاتیناز، لسیتیناز، پروتئاز و آمیلاز بودند. جدایه های B. thuringiensis بیشینه سطح پروتئاز را تولید کردند و بیشینه مقدار زی لایه توسط جدایه های B. subtilis تولید شد. بیشترین هاله بازدارنده عصاره ی دی کلرومتان جدایه های باسیلوس برعلیه B. roseae متعلق به جدایه rAqa2 گونه B. subtilis (با قطر بازداری 25/0±3/18 میلی متر) بود.

نتیجه گیری کلی: 

علاوه بر تنوع حاصل از گروه بندی فنوتیپی و مولکولی، وجود تنوع در برخی از ویژگی های فیزیولوژیکی در جدایه های باسیلوس می تواند نشانگر تاثیر بالقوه بعضی از جدایه ها در تولید هورمون های محرک رشد و افزایش ایمنی گیاهان باشد. همچنین، اثرات ضدباکتریایی و حفاظتی آن ها می تواند به عنوان عوامل زیست کنترل در گیاهان جنگلی در برابر عوامل بیماری زای باکتریایی محسوب شود. این پژوهش، اولین بررسی در زمینه شناسایی مولکولی و تعیین ویژگی های جدایه های باسیلوس درون ‏رست ریشه ممرز در ایران است.