تولید اولین پادزهر سرم اسبی موثر و ایمن در مقابل زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda)

زهر زنبور عسل ترکیبی مایع، بیرنگ و اسیدی (pH 4.5-5.5) است که شامل 18 ترکیب متفاوت مانند آنزیم ها، پپتیدها و آمینه ای زیستی می باشد. برخی از این ترکیبات دارای خواص ضد التهابی و برخی دارای خواص سمی و آلرژن می باشد. مهم ترین پپتیدهای موجود در زهر زنبور ملیتین، آپامین، آدولاپین و پپتید دگرانوله کننده ماست سل هستند. مهمترین آنزیم های موجود در زهر زنبور می توان هیالورونیداز و فسفولیپاز A2 را نام برد. زهر زنبور عسل در ادوار گذشته بخصوص در درمان سنتی همواره به‎ عنوان دارو در درمان بیماری ‎های مختلفی مانند آرتریت روماتویید و همچنین جهت کاهش دردهای عضلانی مورد استفاده قرار گرفته است. زنبورگزیدگی به ‎عنوان یکی از مشکلات در سیستم بهداشت عمومی برخی از کشورهای دنیا از جمله ایران مطرح می باشد. در حال حاضر درمان خاصی برای زنبور گزیدگی وجود ندارد و درمان تا حدودی توسط داروهای شیمیایی انجام می شود. در سال های گذشته پادزهر مبتنی بر Fab از اسب و گوسفند به‎ عنوان یک درمان جدید بالقوه مطرح شده است. تاکنون در ایران اقدامی جهت تولید آنتی ونوم (پادزهر) برای نجات افراد حساس به نیش زنبور صورت نگرفته است. لذا هدف از این تحقیق تولید پادزهر سرم اسبی موثر و ایمن در مقابل زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda) بود. 

مواد و روش‎ها:

 زهر خام از زنبور عسل ایرانی به‎وسیله دستگاه زهرگیر تهیه گردید. زهر در مجاورت هوا سریعا خشک می شود. زهر خشک شده هر روز به‎ کمک کاردک های مخصوص از روی صفحات شیشه ای جمع ‎آوری و برای استفاده بعدی در شیشه های تیره رنگ در فریزر 20- درجه سانتی گراد ذخیره گردید. به‎ هنگام استفاده از سم، برای حذف موکوس و مواد اضافه، سم به نسبت 1 به 1 با محلول سالین (سرم فیزیولوژی) حل شده و با دور بالا سانتریفیوژ می گردد. بعد از سانتریفیوژ محلول شفاف بالایی جدا و با فیلتر 0/2 میکرون فیلتر می گردد. مقدار پروتئین موجود در محلول زهر خام، به ‎روش پروتئین سنجی برادفورد و بر اساس منحنی استاندارد حاصل از سنجش غلظت های مختلف محلول سرم آلبومین گاوی (BSA) تعیین شد. مقدار متوسط دوز کشندگی (LD50) با 24 موش سوری نر تعیین گردید. موش ها به گروه های 4 تایی تقسیم شدند و 0/5 میلی لیتر از دوزهای مختلف زهر (60، 70، 80، 90، 100 و 110 میکروگرم در میلی لیتر) محلول در نرمال سالین استریل به‎ صورت داخل وریدی به آنها تزریق شد. به موش های شاهد 0/5 میلی لیتر محلول نمکی تزریق شد. مرگ و میر پس از 24 ساعت ثبت شد و LD50 بر اساس آنالیز پروبیت محاسبه گردید. در این پژوهش از 3 اسب مادیان بالغ 3 ساله (400 تا 450 کیلوگرم) استفاده گردید. برای ایمن سازی اسب ها زهر زنبور به همراه ادجوانت فروند کامل و ناقص تزریق گردید. در تلقیح اول و دوم از ادجوانت فروند کامل و در تلقیح های بعدی از ادجوانت فروند ناقص استفاده شد. تلقیح سم به صورت افزایشی به ترتیب از 50، 100، 250، 500، 1000، 2000 و 4000 میکروگرم در طی 7 مرتبه با فواصل زمانی 7 روز اجرا شد. تزریق به صورت زیر پوستی (گردن) انجام شد. جداسازی آنتی بادی اسب با پروتکل استاندارد روش آمونیوم سولفات اشباع شده اجرا شد. ارزیابی ایمنی زایی در شرایط آزمایشگاهی  با تست الایزا انجام گرفت. سرم اسب های ایمن شده و نیز آنتی ونوم حاصل از رسوب آمونیوم سولفات اشباع از نظر خنثی سازی سم ارزیابی شدند. جهت بررسی کیفیت پادزهر، خنثی سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت های مختلف پادزهر اجرا شد. در نهایت متوسط دوز موثر (ED50) برای پادزهر در موش سوری تعیین گردید. برای تعیین کارآیی پادزهر اسبی تهیه شده، زهر زنبور به‎صورت دوز افزایشی با مقدار ثابت پادزهر مخلوط و به موش تزریق شد.

یافته‎ ها: 

مقدار LD50 برای زهر زنبور 4/84 میکروگرم برای هر گرم وزن زنده موش به‎دست آمد. نتایج تست الیزا نشان داد که روند پاسخ اسب ها نسبت به زهر افزایشی بوده و به‎ خوبی با آنتی ژن ایمن شده‎اند. خنثی سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت های مختلف پادزهر نشان داد که سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و 120 میکروگرم در میلی لیتر از این پادزهر قادر به خنثی کردن کامل فعالیت سم فسفولیپاز A2 است. از این داده ها مشخص است که اولا سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و دوما 55 میکروگرم پادزهر برای خنثی کردن 50 درصدی فعالیت فسفولیپاز A2 در 100 میکروگرم زهر مورد نیاز است. مقدار ED50 تقریبا 54 برابر LD50 خواهد شد. این بدان معنی است که پادزهر تا 54 برابر LD50 را می تواند خنثی کند. بنابراین مرگ ایجاد شده بوسیله 4 میلی گرم سم زنبور با 1 میلی لیتر پادزهر خنثی می شود به‎ همین دلیل میزان متوسط دوز موثر ED50 برابر با 4 میلی گرم بر میلی لیتر خواهد بود. اگر در هر بار نیش زنبور مقدار 100 میکروگرم زهر وارد بدن شود پس 1 میلی لیتر از این پادزهر می تواند 40 نیش زنبور را خنثی کند.

پادزهر سرم اسبی که علیه سم زنبور عسل ایرانی به‎دست آمد، در مدل حیوانی قادر به خنثی سازی سم بوده و از مرگ موش‎هایی که با سم تلقیح شده بودند جلوگیری می نماید.