ساب کلونینگ و بیان ژن آلفافیتو پروتئین انسانی در مخمر پیکیا پاستوریس

آلفافیتوپروتئین بطور طبیعی در سرم جنینی یافت می شود، در حالیکه تولید و ظاهر شدن آن بعد از تولد حاکی از وجود تومورهای سرطانی است. بنابراین با تعیین مقدار این پروتئین، در دوره های جنینی و بعد از تولد می توان عارضه های مختلف جنینی، توموری و غیر توموری را تشخیص داد. از اینرو تولید و خالص سازی این پروتئین به روش فن آوری DNA نوترکیب به منظور تولید کیت تشخیصی حایز اهمیت بسیار می باشد.
پیکیا پاستوریس مخمر متیلوتروفی است که برای تولید آلفافیتوپروتئین انسانی مورد استفاده قرار گرفت. برای تکثیر قطعه ژن مورد نظر از حامل کلونینگ pUC18 و برای بیان پروتئین از حامل دومیزبانه pHIL-S1 استفاده گردید. بعد از ایجاد پلاسمید نوترکیب pS1-AFP از روش های الکتروپوریشن و روش شیمیایی لیتیوم کلراید برای انتقال به سلولهای مستعد سویه GS115-HIS- استفاده گردید. برای غربالگری نیز از محیط اگزوتروفیک فاقد هیستیدین استفاده گردید. به منظور بررسی نحوه اتصال ژن مورد نظر به ژنوم مخمری و فنوتیپ های حاصله، از روش PCR استفاده شد. در راستای بیان ژنی از محیط های کشت YPG و YPM استفاده گردید و میزان کمی و کیفی تولید پروتئین مورد نظر با استفاده از ژل SDS-PAGE و روش ELISA مورد بررسی قرار گرفت.
برش آنزیمی پلاسمید نوترکیب pS1-AFP ترانسفورم شده حاکی از دریافت قطعه 1.78 Kbp ژن AFP بود که در ژل آگاروز (%1) بدست آمد. PCR به عمل آمده نیز وجود این قطعه را تایید کرد. انتخاب سویه های ترانسفورم شده mutS در مقایسه با mut+ و کشت آنها در محیط گلیسرول (YPG) تا حصول کدورت OD600=6 و سپس انتقال به محیط کشت متانول (YPM) با افزودن متانول تا %1 غلظت نهایی سبب حفظ القا تولید پروتئین در محیط اگزوتروفیک فاقد هیستیدین گردید. میزان تولید این پروتئین حدود 10 ug/ml بدست آمد.
این مطالعه نشان داد که قرار دادن ژن سیگنال ترشحی اسید فسفاتاز و راه انداز AOX1 در ابتدای ژن AFP برای بیان و ترشح این پروتئین مناسب می باشد. بنابراین می توان در راستای تولید آنتی بادی تک دودمانی (منوکلونال) از آن استفاده کرده و با خالص سازی آن کیت های تشخیصی آزمایشگاهی را طراحی کرد.