طراحی و ساخت پلاسمید حاوی کاست بیانی فیوژن پروتئین CFP-10، ESAT-6 مایکوباکتریوم توبرکولوزیس

در قرن گذشته تنها روش تشخیص عفونت نهفته مایکوباکتریوم توبرکولوزیس آزمایش پوستی توبرکولین بود. این آزمایش در بیماران آلوده با دیگر مایکوباکتریوم ها و در افراد واکسینه با BCG نتایج مثبت کاذب دارد. لذا، لزوم روش های تشخیصی کارآمد، سریع و دقیق مطرح می شود. دو آنتی ژن CFP-10و ESAT-6 در تمام مایکوباکتریوم های پاتوژن وجود دارد ولی در سویه های مولد واکسن BCGو مایکوباکتریوم های فرصت طلب از جمله مایکوباکتریوم آویوم وجود ندارد. هدف این مطالعه ساخت سازه بیانی فیوژن پروتئین متشکل از دو ژن اختصاصی رمز کننده CFP-10و ESAT-6 بود. این فیوژن پروتئین در آزمایش اختصاصی تشخیص عفونت فعال و نهفته مایکو باکتریوم توبر کولوزیس به کار برده می شود.
DNA مایکوباکتریوم توبرکولوزیس(H37Rv)استخراج و تعیین غلظت گردید. برای تکثیر قطعات ESAT-6، CFP-10 و قطعه شامل ESAT-6 و CFP-10 پرایمر طراحی گردید و PCR و Overlap PCR انجام شد. محصول PCR حاصل از فیوژن ESAT-6 و CFP-10 در پلاسمید pTZ57T/A کلون شد. سپس پلاسمید pQE-60 وpT-ESAT-CFP با دو آنزیم BamHI و NcoI هضم شد. محصول هضم آنزیمی روی ژل آگارز، الکتروفورز شد. باندهای DNA حاوی ESAT-CFP و pQE-60 خطی شده از ژل آگارز استخراج گردید. قطعه ESAT-CFP در pQE-60 کلون مجدد شد. کلون های به دست آمده با PCR، هضم آنزیمی وتعیین توالی ارزیابی گردید. پلاسمید نهایی pQ-ESAT-CFP نامیده شد.
محصولات PCR، پلاسمید pT-ESAT-CFP و پلاسمید نهایی با هضم آنزیمی و تعیین توالی تایید شدند.
با بیان سازه ژنی pQ-ESAT-CFP و تخلیص فیوژن پروتئین حاصل می توان از آن برای ساخت کیت تشخیصی مایکوباکتریوم توبرکولوزیس، جایگزین آزمایش توبرکولین، استفاده کرد.