داود درستکار مقدم

کریپتوسپوریدیوم یکی از مهم ترین انگل های پاتوژن روده ای است که سبب اسهال در انسان و حیوانات می شود. با توجه به نقش کریپتوسپوریدیوم در بروز اسهال و ایجاد مرگ و میر در بیماران مبتلا به نقص سیستم ایمنی و کودکان زیر 5 سال، در بررسی حاضر میزان فراوانی نسبی و مطلق آلودگی به این انگل و رابطه آن با بعضی از عوامل دموگرافیک در استان اصفهان مورد ارزیابی قرار گرفته است.
این مطالعه به روش توصیفی از مهرماه 1382 لغایت فروردین ماه 1383 در استان اصفهان انجام گردید. در این مطالعه تعداد 642 نمونه مدفوع از کودکان زیر 5 سال، بیماران مبتلا به ضعف سیستم ایمنی و افراد در معرض خطر بیماری جمع آوری شد و با روش شناورسازی در محلول قندی (Sheather’s) و رنگ آمیزی با متد ذیل نلسون اصلاح شده مورد بررسی قرار گرفتند.
از مجموع نمونه های مورد بررسی، 30 نمونه (7/4 درصد) آلوده به انگل تشخیص داده شد. میزان آلودگی در کودکان زیر 5 سال، بیماران مبتلا به ضعف سیستم ایمنی و افراد در معرض خطر به ترتیب 6/4 درصد، 5/3 درصد و 4/5 درصد برآورد گردید. بیشترین میزان آلودگی در کودکان در گروه سنی 1 تا 2 سال (10 درصد)، در بیماران مبتلا به ضعف سیستم ایمنی در گروه سنی 43 ساله (2/6 درصد) و در افراد در معرض خطر بیماری در گروه سنی 105 سال (8/14 درصد) مشاهده گردید.
کریپتوسپوریدیوم در میان کودکان زیر 5 سال، افراد با نقص سیستم ایمنی و افراد در معرض خطر، شیوع بالایی را در استان اصفهان دارد. از این رو، باید از سوی مسئولین بهداشتی کشور تدابیری در نظر گرفته شود که به واسطه آن آلودگی در این افراد شناسایی و درمان شود و در نتیجه از انتقال بیماری در سطح جامعه جلوگیری شود.

کریپتوسپوریدیوم یکی از مهمترین انگل های پاتوژن روده ای است که سبب اسهال در انسان و حیوانات می شود. در افراد با سیستم ایمنی کارآمد عفونت ناشی از انگل خودبخود بهبود می یابد اما در اشخاص مبتلا به نقص سیستم ایمنی عفونت ناشی از انگل طولانی مدت بوده و می تواند منجر به مرگ این افراد شود. به دلیل اهمیت بیماری مذکور و تاثیر تنوع گونه های انگل در طراحی استراتژی های کنترل بیماری، ایزوله های انسانی و حیوانی کریپتوسپوریدیوم جهت تعیین نوع گونه ها با استفاده از روش PCR -RFLP مورد بررسی قرار گرفتند.
در این بررسی نمونه های مدفوع انسانی و دامی جمع آوری شده از نقاط مختلف استان اصفهان با استفاده از روش های آزمایشگاهی ویژه مورد بررسی و تخلیص قرار گرفتند و در نهایت بر روی DNA استخراج شده از ایزوله ها عملیات PCR - RFLP انجام گردید. جهت تعیین هویت گونه های انگلی شناسایی شده عملیات تعیین توالی ژنوم (sequencing) بر روی ژن 18s rRNA انجام شد. نتایج بررسی های میکروسکوپی نشان داد که 4.7 درصد از نمونه های انسانی و 6.2 درصد از نمونه های دامی آلوده به انگل هستند. نتایج PCR - RFLP نشان داد که نمونه های مورد آزمایش آلوده به Cryptosporidium parvum II، C. baileyi، C. serpentis، C. muris، C. wrairi و سه ژنوتیپ جدید کریپتوسپوریدیوم می باشند. با انجام تعیین توالی هویت واقعی این گونه های انگلی تعیین شد.
با توجه به الگوی PCR - RFLP ژن 18s rRNAایزوله های انسانی و حیوانی در اثر هضم آنزیمی با آنزیم های برش دهنده SpeI و SspI می توان نتیجه گرفت که در استان اصفهان اکثر ژنوتیپ های کریپتوسپوریدیوم به ویژه C. parvum وجود دارد. همچنین ممکن است تغییرات شدید پلی مرفیک در انگل های کریپتوسپوریدیوم این منطقه وجود داشته باشد و یا موتانهایی از این جنس نیز در منطقه وجود داشته باشند که الگوهای متفاوتی را ایجاد می کنند و پی بردن به هویت این موتانها نیاز به تعیین توالی ژنوم آنها دارد. علاوه بر این وجود سویه های دامی در ایزوله های به دست آمده از انسان تداخل سیکل انسان – دام - انگل و اهمیت سویه های دامی را در کنار سویه های انسانی در منطقه نشان می دهد.

با توجه به فقدان یک روش استاندارد برای تهیه و خالص سازی آنتی ژنهای انگل توکسوپلاسما گوندی از سویی، و عدم امکان تشخیص زمان ایجاد عفونت از سوی دیگر، استفاده از آنتی ژنهای خالص نو ترکیب که مربوط به مراحل آغازین تکثیر انگل بوده و با استفاده از دانش بیولوژی مولکولی تهیه شده باشند مورد توجه بسیار قرار گرفته است. هدف از انجام این کار، در اختیار داشتن ژن کلون شده در پلاسمید است تا با استفاده از بیان ژن بتوان به آنتی ژن نوترکیب انگل دست یافت.
قسمتی از ژن P35 که توالی سیگنال آنتی ژن را شامل می شود با استفاده ازواکنش زنجیره پلیمراز (PCR) تکثیر شد و پس از خالص سازی و انجام Ligation درون و کتور pGEM-5z کلون شده و به وسیله ترانسفورماسیون به باکتری منتقل گردید. کلون شدن ژن با استفاده از Restriction Enzyme Analysis وColony-PCR تایید شد. پلاسمی نو ترکیب حاصله برای حصول اطمینان از صحت توالی ژن کلون شده به وسیله تعیین توالی مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتیجه الکتروفورز محصول PCR تکثیر شدن قطعه ای 450جفت بازی را نشان داد. انجام Colony- PCR در مورد کلنی هایی که به روش? - Completation غربالگری شده بودند نشان دهنده وجود قطعه DNA مورد نظر درMultiple Cloning Site وکتور مورد استفاده بود و انجام Restriction Enzyme Analysis برروی پلاسمیدهای استخراج شده این امر را تایید کرد. ارزیابی توالی تعیین شده به وسیله نرم افزارBLAST نشان داد سکانس ژن مذکور با داده های موجود در بانک ژن همپوشانی قابل توجهی دارد.
کلون شدن ژن مرتبط با آنتی ژن P35 توکسوپلاسما در وکتور GEM دو امکان مهم را در اختیار ما قرار می دهد. یکی اینکه با وارد ساختن ژن کلون شده به درون باکتری، نگهداری ژن را به مدت طولانی برای کاربردهای مکرر میسر می سازد و به همراه تکثیر پلاسمید، ژن درون پلاسمید نیز تکثیر می یابد. دوم اینکه قرار داشتن محل اثر آنزیم های برشگر خاص در دو سر قطعه ژن، این امکان را فراهم می آورد که با اثر دادن آنزیم های مذکور، به راحتی بتوان ژن مورد نظر را از وکتور خارج ساخته و جهت بیان ژن و تهیه پروتئین نوترکیب، این ژن را در یک وکتور بیان، ساب کلون نمود. همچنین مشاهده تطابق توالی به دست آمده با اطلاعات موجود، تاییدی برنتایج مطالعات است که با استفاده از بررسی مقایسه ای توالی ژنهای توکسوپلاسما و روشذ (Restriction Fragment Length Polymorphism) RFLP صورت گرفته و نشان می دهد که بین سه دودمان ژنتیکی موجود برای توکسوپلاسما، فارغ از محل جغرافیایی جدا شدن انگل، از نظر توالیDNA حداکثر تا 1% اختلاف ممکن است وجود داشته باشد.

لیشمانیوز احشایی انسانی (HVL) در استان های فارس و اردبیل به صورت آندمیک و در سایر مناطق کشور به شکل تک گیر (Sporadic) گزارش شده است. لیمشانیوز احشایی در ایران از نوع مدیترانه ای و عامل آن لیشمانیا اینفانتوم (L. infantum) و مخزن آن سگ می باشد. این بیماری در ایران بیشتر بچه ها را مبتلا می کند و در صورت عدم تشخیص زود هنگام، عوارض خطرناکی را پدید می آورد.
در این مطالعه با استفاده از آنتی ژن استاندارد شده، روش آگلوتیناسیون مستقیم (DAT) با روش ایمونوفلورسانس غیر مستقیم (IFAT)، مورد مقایسه قرار گرفت. آنتی ژن مورد نیاز، از پروماستیگوت های سویه L.infantum (MHO/TN/80/IPTi) در گروه انگل شناسی دانشکده پزشکی تهیه، استاندارد و مورد استفاده قرار گرفت. به همین منظور پروماستیگوت های لیشمانیا در محیط های کشت N.N.N و RPMI1640 به مرحله تولید انبوه رسید. مراحل تهیه آنتی ژن DAT به طور کلی شامل تریپسینه شدن، فیکس با فرمالدیید و رنگ آمیزی با کوماسی بلو (Comassie blue) می باشد. هم چنین آنتی ژن IFAT با استفاده از پروماستیگوت های کشت داده شده در محیط RPMI 1640، پس از مراحل شست و شو و فرمالینه شدن، بر روی لام مخصوص میکروسکپ فلورسانس فیکس و آماده گردید. سپس سرم های تهیه شده (70 نمونه) با دو روش DAT و IFAT مورد آزمایش قرار گرفت.
نتایج به دست آمده، در این مطالعه نشان داد که نسبت سرم های مثبت Sero-positive rate (SPR) در روش DAT در ترازهای 1:3200 و بالاتر، 91.4 درصد و در روش در ترازهای 1:80 و بالاتر، 94.3 درصد می باشد. (GMRT) Geometricmeans of reciprocal titer برای روش DAT برابر 6309 و در روشIFAT برابر 316 به دست آمد.
با توجه به ترازهای به دست آمده در هر دو روش، تراز 1:3200 روش DAT ارزشی معادل تراز 1:80 روش IFAT دارا می باشد. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد هر چند که آزمون IFAT جهت تشخیص بیماران مبتلا به کالا آزار از کارایی خوبی برخوردار است، نیاز به یک آزمایشگاه مجهز می باشد؛ در صورتی که روش DAT یک روش ساده، ارزان و قابل اجرا در مناطق روستایی (آندمیک) و جایگزین مطمئن برای روش پر هزینه IFAT می باشد.

کریپتوسپوریدیوم یکی از انگل های داخل سلولی اجباری از شاخه اپی کمپلکسا است که در جهان به عنوان عامل بیماری گاستروآنتریت در میزبانان پستاندار از جمله انسان شناخته شده است. در مراحل اولیه بیماری، کریپتوسپوریدیوم باعث عفونت سلولهای اپی تلیال روده و معده می شود و در نتیجه شکل های مختلفی از بیماری را به صورت اسهال حاد، اسهال های خود محدود شونده و موارد مرگ و میر و شدید بیماری را در مبتلایان به نقص سیستم ایمنی به ویژه مبتلایان به سندرم نقص ایمنی اکتسابی (ایدز) ایجاد می نماید. با توجه به اهمیت بهداشتی این انگل در جهان، جداسازی و تخلیص این انگل جهت شناسایی خصوصیات آنتی ژنیک و تعیین سویه های مختلف آن ضروری به نظر می رسد.
در مطالعه حاضر، تعداد 480 نمونه مدفوع از گوساله های استان اصفهان جمع آوری و با روش شناورسازی در محلول قندی (Scheater) رنگ آمیزی اسید فاست اصلاح شده مورد بررسی قرار گرفتند که از این تعداد، 30 نمونه آلوده به انگل تشخیص داده شد. نمونه های مدفوع آلوده با روش گرادیانت منقطع ساکارز تخلیص شد و در دی کرومات پتاسیم 2.5% نگهداری شدند.
تکنیک های بکار گرفته شده جهت جداسازی و تخلیص اووسیست ها و اسپروزوئیت های کریپتوسپوریدیوم از نمونه های به دست آمده در اندازه بسیار زیاد، شامل روش های گرادیانت منقطع ساکارز و گرادیانت پرکول بود. با این روش ها، اووسیست های انگل با انجام دو مرحله بودند و 34% از نمونه های جمع آوری شده اصلی را شامل می شدند.
اسپروزوییت های انگل بوسیله یک مرحله گرادیانت پرکول از مخلوط اووسیست های در حال تخریب جداسازی شدند. 63% از اسپروزوییت های اصلی جدا شده با 2.2% از اووسیست های دست نخورده و اووسیست های بدون دیواره همراه بودند. اسپروزوئیت های جداسازی شده جهت آزمایشات ELISA، آنالیز آنتی ژن به وسیله SDS-PAGE و وسترن بلات (Westernblot) و نیز برای تجزیه اسید نوکلوییک(DNA) مناسب می باشند.

کریپتوسپوریدیوزیس بیماری انگلی تک یاخته ای شایع در جهان می باشد و موجب انواعی از مشکلات از جمله اسهال حاد خود محدود شونده تا موارد مرگ در افراد با نقص ایمنی خصوصا در مبتلایان به ایدز (AIDS) می گردد. تشخیص کریپتوسپوریدیوم با نشان دادن اووسیست های انگل (Oocysts) در نمونه مدفوع مبتلایان که اساسا با رنگ آمیزی اسید فاست (Acid fast staining) که از حساسیت و ویژگی پایینی برخوردار است انجام می شود.

در مطالعه حاضر مزایا و فواید کاربرد تشخیصی یک سنجش ایمنی آنزیمی (EIA) را به منظور تعیین آنتی ژن اختصاصی کریپتوسپوریدیوم (CSA) Cryptosporidium-Specific Antigen در 204 نمونه مدفوع فرآوری نشده (بدون ماده نگهدارنده) به دست آمده از بیماران کمتر از سه سال را ارزشیابی و با روش تشخیصی روتین که در این مطالعه بهکار رفته است (نشان دادن اووسیست ها با رنگ آمیزی اسید فاست و بررسی میکروسکوپی و تایید نتایج مثبت با IFA) مقایسه و مشخص شد که از حساسیت و ویژگی 98% برخوردار می باشد.

از 139 نمونه منفی با بررسی میکروسکوپی، 13 مورد (3/9%) با روش EIA مثبت بودند و 11 مورد از این تعداد نیز با روش ممانعت با آنتی کر در برابر آنتی ژن اختصاصی کریپتوسپوریدیوم (Cryptosporidium Specific Antigen Inhibition Test) تایید شدند.

نتایج به دست آمده نشان داد که EIA روش مهمی در تشخیص کریپتوسپوریدیوم در نمونه های مدفوع است زیرا حساس و اختصاصی بوده، کاربرد آن آسان است و تحت تاثیر حضور مواد نگهدارنده قرار نمی گیرد.

ژیاردیا لامبلیا (Giardia lamblia) تک یاخته تاژک دار روده ای و از عوامل ایجاد کننده اسهال می باشد که در موارد شدید و اغلب در کودکان به اسهال چرب و کاهش وزن بیمار منتهی می گردد. از زمانی که کشت G.lamblia در محیط آزمایشگاهی امکان پذیر شد، مطالعات بسیاری در جهت بکارگیری روش های تشخیص تکمیلی سرواپیدمیولوژیک روی این انگل صورت گرفته است. مطالعه حاضر تعیین تیتر آنتی بادی ضد G.lamblia با روش ایمونوفلورسانس غیرمستقیم (IFA) در دو گروه افراد بیمار (دفع کنندگان انگل) که در حداقل یک نمونه مدفوع آنها کیست و یا تروفوزوئیت مشاهده شده و افراد سالم (کنترل) که نتیجه آزمایش سه نوبت آنها از نظر ژیاردیا لامبلیا منفی بوده است، می باشد. آنتی ژن مورد استفاده در این بررسی تروفوزوئیت G.lamblia حاصل از محیط کشت TYI-S-33 می باشد. بررسی روی نمونه سرم 50 بیمار و 50 نفر سالم در شهر اصفهان از بین مراجعه کنندگان به آزمایشگاه انگل شناسی در گروه های سنی مختلف صورت گرفت. تمام افراد بیمار (دفع کنندگان انگل) دارای آنتی بادی ضد ژیاردیا بودند که حداقل تیتر در این افراد 1:2 و حداکثر 1:256 بود، (76 درصد) 36 نفر از بیماران دارای تیتر آنتی بادی 2? 1:16 بودند. در گروه کنترل (34 درصد) 17 نفر از نظر تیتر آنتی بادی منفی و (66 درصد) 33 نفر مثبت بودند. حداقل تیتر آنتی بادی در این گروه 1:2 و حداکثر 1:64 بود. با انجام تست t و آزمون تفاوت میانگین دو گروه، مشاهده گردید که بین گروه بیماران (دفع کنندگان انگل) و گروه کنترل از نظر تیتر آنتی بادی اختلاف معنی داری وجود دارد. آزمایش IFA برای تشخیص ژیاردیازیس در افرادی که دارای علائم بالینی بوده ولی در آزمایش چند نوبت مدفوع منفی می باشد، می تواند مورد بررسی قرار گیرد. در بررسی حاضر تیتر 1:16 به عنوان ملاک تشخیص پیشنهاد شده است.