به جمع مشترکان مگیران بپیوندید!

تنها با پرداخت 70 هزارتومان حق اشتراک سالانه به متن مقالات دسترسی داشته باشید و 100 مقاله را بدون هزینه دیگری دریافت کنید.

برای پرداخت حق اشتراک اگر عضو هستید وارد شوید در غیر این صورت حساب کاربری جدید ایجاد کنید

عضویت
فهرست مطالب نویسنده:

محمدرضا صفرنژاد

  • سعید سهیلی وند*، محمدرضا صفرنژاد

    بیماری جاروی جادوگر لیمو ترش، یک بیماری مهلک و قرنطینه ای است که به طور وسیعی باغات لیمو ترش جنوب کشور را تهدید می کند. عامل این بیماری فیتوپلاسمایی از طریق روش های مختلفی مانند حشرات ناقل، پیوند پیوندک آلوده و استفاده از ابزار آلوده می تواند به درختان سالم لیمو ترش منتقل شود. متاسفانه بدلیل قرنطینه ای بودن آن، امکان بسیاری از پژوهش ها و راستی آزمایی ها در سطح باغ و محیط آزاد وجود ندارد. بنابراین پژوهش های علمی اولیه در مورد برهمکنش عامل بیمارگر و گیاه، عوامل پیشرفت بیماری، تست روش های مختلف کنترل و مدیریت بیماری، بررسی گیاهان تراریخته متحمل به بیماری، آزمون کیت های تشخیصی باید در محیط های کنترل شده انجام شود. هدف از اجرای این پژوهش یافتن بهترین شرایط برای تولید گیاهان آلوده به بیماری فیتوپلاسما است تا بتوان در قدم های بعدی در مطالعات تکمیلی از آنها استفاده کرد. در این پژوهش با استفاده از پیوندک های آلوده و سالم (به عنوان کنترل) و با استفاده از دو نوع پیوند جوانه از نوع شکمی (T معکوس) و پیوند انتهایی و با بررسی شرایط پیوند و مشخصات پایه و پیوندک مشخص شد که پیوند جوانه نسبت به پیوند انتهایی از موفقیت بیشتری در انتقال بیماری برخوردار بوده است.

    کلید واژگان: پیوندک, پایه, بیماری جاروک, انتقال بیماری
    Saeed Soheilivand*, Mohammadreza Safarnegad

    The lime tree witches' broom disease is a lethal and quarantine-regulated disease that poses a significant threat to lime orchards in southern Iran. The disease can be transmitted to healthy lime trees through various methods, including insect vectors, infected scions, and the use of contaminated tools. Unfortunately, due to its quarantine status, extensive research and testing opportunities in open field conditions are limited. Therefore, many scientific studies must be conducted in isolated and controlled locations such as growth chambers and greenhouses to perform initial scientific research on the interaction between the pathogen and the plant, factors contributing to disease progression, testing various control and management methods, examining disease-tolerant plant varieties, and testing diagnostic kits in controlled environments. The objective of this research is to find the best conditions for producing plants infected with the phytoplasma disease, which can be used in subsequent studies. In this study, both infected and healthy scions (as controls) were utilized with two types of T-budding (inverted T) and terminal grafting. By analyzing grafting conditions and the characteristics of rootstocks and scions, it was determined that budding grafts were more successful than terminal grafts in transferring the disease.

    Keywords: Scions, Rootstock, Witches' Broom Disease, Disease Transmission
  • نیلوفر رجبی، محمدرضا صفرنژاد، فرشاد رخشنده رو *، مسعود شمس بخش، حجت الله ربانی

    امروزه زیست حسگر های الکترو شیمیایی به دلیل حساسیت و دقت بالا در ردیابی اسید های نوکلئیک هدف مورد توجه بسیار قرار گرفته اند. از طرفی به دلیل اهمیت اقتصادی درختان انجیر، تشخیص سریع و دقیق بیماری های آن از جمله بیماری موزائیک انجیر، Fig Mosaic Disease (FMD)، به عنوان یکی از مهم ترین و مخرب ترین بیماری های ویروسی درختان انجیر، نقش موثری در مدیریت این بیماری ایفا می کند. در این مطالعه، نانو زیست حسگر الکترو-شیمیایی مبتنی بر DNA و فاقد نشانگر مولکولی برای شناسایی کیفی و کمی ویروس FMV در نمونه های آلوده بهینه سازی شد. در این راستا، جهت بهینه سازی و بهبود عملکرد زیست حسگر طراحی شده، پارامتر های غلظت کاوشگر DNA برای تشکیل تک لایه های خود انباشته و زمان لازم جهت انجام فرآیند هیبریداسیون در محدوده زیستی با بیشترین تاثیر در زیست حسگر DNA، مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به داده های منحنی کالیبراسیون، اولین محدوده خطی 3- میکرومولار تا 3 میکرومولار با معادله خط y = 4.81x+34.58 و ضریب تشخیص (9967/0=R2) به-دست آمد. زیست حسگر بهینه سازی شده در این پژوهش جهت تشخیص ماده ژنتیکی FMV دارای پایداری،گزینش پذیری بالا و همچنین کاربری آسان و سریع بوده که نوید یک روش تشخیصی با کارایی و دقت بالا جهت شناسایی این ویروس را می دهد.

    کلید واژگان: ویروس موزاییک انجیر, زیست حسگر الکترو شیمیایی, بهینه سازی, کالیبراسیون
    Niloofar Rajabi, Mohammadreza Safarnejad, Farshad Rakhshandehroo *, Masoud Shamsbakhsh, Hodjattallah Rabbani

    Today, electrochemical biosensors are highly regarded due to their high sensitivity and accuracy in tracking target nucleic acids. On the other hand, due to the economic importance of fig trees, rapid and accurate diagnosis of its diseases, including Fig Mosaic Disease (FMD), which is one of the most important and destructive viral diseases of fig trees plays an effective role in the management and control of this disease. In this study, a novel label free electrochemical DNA-based biosensor was optimized to qualitatively and quantitatively identify the presence of FMV in the infected samples. In this regard, in order to optimize and improve the performance of the designed biosensor, the concentration parameters of the DNA probe to form self-assembled monolayers and the time required to perform the hybridization process in the biological range with the greatest impact on the DNA biosensor were investigated. According to the data of the calibration curve, the first linear range at -3 μM to 3 μM was obtained with the equation of the line y= 4.81x+34.58 and the detection coefficient (R2= 0.9967). In this research, the omtimized biosensor to detect a stable, high selective, easy and fast FMV-DNA, promises a diagnostic method with high efficiency and accuracy.

    Keywords: Fig Mosaic Virus, DNA Label Free Electrochemical Biosensor, Optimizing, Calibration
  • Kheyzaran Dolatabadi, Gholamhossein Davarynejad*, Mohammad Reza Safarnejad, Zeinab Ghayoor

    Grapevine viruses cause significant losses in the yield of grape. This study describes applying silver nanoparticles (AgNPs) to produce virus-free grapevine plants and compares it with chemo and thermotherapy. Preliminary molecular analysis proved the presence of Grapevine fanleaf virus (GFLV) and grapevine leafroll-associated virus-1 (GLRaV-1) in the ʻAsgariʼ, ʻPeykaniʼ, and ʻShahaniʼ cultivar samples, then single node explants were cultivated in the MS medium. Thermotherapy at 35 ± 1 ºC and cycles of 35/38 ± 1 ºC, chemotherapy with ribavirin 0, 20, 25, and 30 μg.ml-1 and using AgNPs at 0, 10, 15, and 20 ppm in medium and 40, 50, and 60 ppm sprayed during acclimatization stage were applied to obtain virus-free explants. The results indicated that using 20 ppm AgNPs in medium and AgNPs combined treatment (15 ppm AgNPs in medium and sprayed with 50 ppm AgNPs in the acclimatization stage) were the most effective treatments for the elimination of viruses. The best treatment led to 100% eradication of GLRaV-1 and 67% of GFLV in ʻAsgariʼ, 100% eradication of GLRaV-1 and GFLV in ʻPeykaniʼ and 100% eradication of GLRaV-1 and 67% of GFLV in ʻShahaniʼ. Furthermore, applying of AgNPs improved plant growth parameters, including plant height, which in infected plantlets was (18.06, 12.36, and 14.92 cm in ʻAsgariʼ, ʻPeykaniʼ, and ʻShahaniʼ, respectively) less than virus-free plantlets. Leaf number was 45, 34, and 27 in virus-free plantlets of ʻAsgariʼ, ʻPeykaniʼ, and ʻShahaniʼ, respectively, but in infected plantlets, it was 24.40, 19.80, and 12. Leaf area increased from 5.34, 5.50, and 5.94 cm2 in infected plantlets to 9.56, 11.43, and 12.33 cm2 in virus-free plantlets of ʻAsgariʼ, ʻPeykaniʼ, and ʻShahaniʼ, respectively. Complementary results proved that chlorophyll content in virus-free is significantly higher than in virus-infected plantlets, which explains and confirms the change in growth parameters after virus removal.

    Keywords: Grapevine, GLRaV-1, GFLV, nanoparticle, AgNPs
  • سمیرا شاملی*، نوح شهرآیین، محمدرضا صفرنژاد
    سابقه و هدف

    سویا گیاهی متعلق به تیره بقولات و از مهم ترین دانه های روغنی در جهان است. استان های شمالی ایران عمده ترین مناطق کشت سویا در کشور می باشند اما در طی سالیان متمادی عارضه ای با نام اختلال در غلاف بندی سویا منجر به کاهش محصول در این مناطق شده و تا 100 درصد خسارت وارد کرده است. عارضه اختلال در مزارع دیر کاشت شدیدتر است و با علایمی از قبیل سبز ماندن بوته ها، تجمع گل ها و غلاف ها، غلاف های غیرطبیعی، سوختگی جوانه و عدم تشکیل دانه در غلاف همراه است. مطالعات قبلی حاکی از نقش احتمالی ویروس ها در بروز عارضه اختلال بوده است. این تحقیق به منظور بررسی نقش نپوویروس ها بر عملکرد و ارقام سویا، و نقش احتمالی آنها در بروز عارضه اختلال درغلاف بندی سویا انجام شد.

    مواد و روش ها

      به منظور بررسی نقش احتمالی نپوویروس ها در بروز عارضه اختلال، تعداد770 نمونه سویا قبل و بعد از بروز عارضه اختلال از استان گلستان جمع آوری گردید و حضور نپوویروس ها توسط آزمون های الایزا و RT-PCR مورد بررسی قرارگرفت. بررسی واکنش سویا نسبت به ویروس های مورد مطالعه و عارضه اختلال، در گلخانه و شرایط طبیعی انجام شد. در گلخانه دو رقم کتول و سامان در مرحله 4 تا 6 برگی به صورت مکانیکی مایه زنی شدند. برای مقایسه واکنش ارقام به ویروس های مورد بررسی و عارضه اختلال در شرایط مزرعه، آزمایشی به صورت طرح اسپیلت پلات با سه فاکتور استفاده از توری جهت جلوگیری از فعالیت آفات، مایه زنی ویروس و ارقام سویا در سه تکرار و در دو سال پیاپی در مرکز تحقیقات کشاورزی استان گلستان انجام شد. نپوویروس ها در کرت های خاص روی بوته های سویا در مرحله 4-6 برگی مایه زنی شدند. جهت اطمینان ازآلودگی گیاهان به ویروس های تلقیح شده، از آزمون های ELISA و RT-PCR استفاده گردید و شاخص های رشد در مرحله رشد فیزیولوژیکی اندازه گیری شد. آنالیز داده ها با آزمون واریانس دو طرفه (ANOVA)، و مقایسه میانگین ها با آزمون LSD در سطح اطمینان 5 درصد، و با استفاده از نرم افزار SPSS (نسخه 16) انجام گردید.

    یافته ها

    مقایسه فراوانی ویروس ها در بوته های دارای عارضه و فاقد عارضه، ارتباط معنی داری بین ویروس های مورد بررسی و عارضه اختلال در غلاف بندی نشان نداد. مایه زنی ویروس ها در بوته های سویا در گلخانه سبب بروز علایمی به صورت کلروز، کوتولگی بوته ها و نکروز سیستمیک شد اما علایم مشخص عارضه اختلال از قبیل ریزش شدید گل ها، گلدهی مجدد بوته ها و سبزماندن بوته ها ایجاد نگردید. در آزمایش اجرا شده در شرایط طبیعی، عارضه اختلال در همه ارقام مورد مطالعه مشاهده شد اما میزان وقوع آن در میان ارقام مختلف، متفاوت بود و رقم ویلیامز دارای کمترین میزان اختلال درغلاف بندی در همه تیمارها بود. بیشترین و کمترین میزان شاخص های رشدی به ترتیب در تیمار عدم مایه زنی ویروس و استفاده از توری، و تیمار مایه زنی ویروس و عدم استفاده از توری مشاهده شد. مایه زنی مکانیکی ویروس ها برروی ارقام مختلف سویا اگرچه سبب کاهش شاخص های رشدی و کاهش عملکرد سویا گردید لیکن در ایجاد غلاف های دارای اختلال، تاثیرمعنی داری نداشت. در تیمارهایی که کنترل آفات مکنده صورت نگرفته بود وقوع عارضه اختلال به طور معنی داری نسبت به سایر تیمارها بیشتر بود.

    نتیجه گیری

    مایه زنی ویروس ها در بوته های سویا در گلخانه و شرایط طبیعی سبب بروز عارضه اختلال درغلاف بندی نگردید. ویروس ها در بوته های سویا به دلیل تنشی که به گیاه سویا وارد می آورند موجب کاهش شاخص های رشدی و تشدید عارضه می گردند اما احتمالا نمی توانند به تنهایی عامل بروز عارضه اختلال باشند. عارضه اختلال در تیمارهایی با عدم کنترل آفات مکنده به طور معنی داری بیشتر بود و لذا نقش آفات مکنده، موثر و مهم تلقی گردید.

    کلید واژگان: آفات مکنده, سویا, عارضه اختلال, نپوویروس
    Samira Shameli *, Noah Shahraeen, Mohammad Reza Safarnejad
    Introduction

    Soybean is a plant belonging to the Fabaceae family and is one of the most important oil seed in the world. The northern provinces of Iran are the main soybean cultivation regions in the country, but over the years, soybean podding disorder has reduced yield in this regions and caused up to 100% damage. The disorder is more severe in late planting farms, and symptoms can be observed as plant greening, accumulation of flowers and pods, abnormal pods, bud blight, and lack of seed in pod. The results of previous studies have shown the possible role of viruses in occurrence of soybean disorder. This research was conducted to investigate the Nepovirus effect on soybean yield and cultivars, and possible role on soybean podding disorder.

    Materials and Methods

    770 soybean sample from Golestan provinces were collected befor and after disorder appeared, and tested by DAS-ELISA and RT-PCR test for investigate the possible role of Nepovirus in disorder. The response of soybean cultivars to Nepovirus and soybean podding disorder, was evaluated in greenhouse and natural conditions. In greenhouse, 2 soybean cultivars (Katol, Saman) were inoculated mechanically at the 4-6 leaf stage. For comparison of soybean cultivars response to studied viruses and evaluation of possible role of Nepovirus on soybean podding disorder in natural condition, the experiment was performed in Golestan Agricuitural Research center as a split plot design with three factors: using net, virus inoculation and soybean cultivars with 3 replications in two years. Nepoviruses inoculated on specific plots on soybean plants at 4-6 leaf stages. ELISA and RT-PCR tests were used to ensure the plants infection with inoculated viruses, and growth indices were measured at physiological growth stage. Data were analyzed by two-way ANOVA, and the means were compared with LSD test at 5% confidence level, using SPSS software version 16.0.

    Results and Discussion

    Comparing of viruse frequency in not disorder plants with podding disorder plants, did not show significant relationship between viruses and disorder incidence. In greenhouse, virus inoculation on soybean plants, caused chlorosis, stunt and systemic necrosis, but the typical symptoms of disorder such as severe falling of flowers, re-flowering, and plant greening did not show. In natural conditions, disorder was observed in all soybean cultivars, but disorder incidence was different among cultivars, and Williams variety showed less disorder in four treatments. The highest and lowest plant growth indices were observed in non-inoculation virus with use of net treatment and, virus inoculation with no use of net, respectively. Mechanical virus inoculation on different soybean cultivars, although reduced growth indices and soybeans yield, but had no significant effect on the podding disorder. In treatments with not controlling of sucker pests, the incidence of disorder was significantly higher than other treatments.

    Conclusion

    Virus inoculation on soybean plants in greenhouse and natural conditions did not cause podding disorder syndrome. Viruses in soybean plants, reduce growth indices and aggravate disorder due to the stress they inflict on the soybean plant, but are not probably the cause of the disorder alone. In treatments with not controlling of sucker pests, disorder incidence was significantly higher, so the role of sucker pests was estimated effective and important.

    Keywords: Sucker pest, soybean, Podding Disorder, Nepovirus
  • محمد رمضانی کپورچالی، محمدرضا صفرنژاد، ابوالقاسم قاسمی، ناصر فرخی*

    باکتری Burkholderia gladioli pv. gladioli (Bgg) عامل بیماری پوسیدگی بنه زعفران از بیماری های شایع این گیاه است. روش های شناسایی دقیق نقش مهمی در مدیریت کنترل بیماری خواهند داشت. تاژک، وسیله اصلی حرکت در باکتری ها است و از اهمیت خاصی در کلونیزاسیون، استقرار و بیماریزایی برخوردار است. ژن fliC یکی از پنج ژن کد کننده فلاژلین می باشد. در این مطالعه، ژن های فلاژلین یازده گونه باکتریایی انتخاب شدند که با آنالیز فیلوژنتیکی در گروه های باکتری های گیاهی و جانوری جای گرفتند. تصاویر میکروسکوپ الکترونی از تاژک طول آن را حداکثر 9 میکرون با قطری معادل 600-400 نانومتر به دو شکل لوفوتریش و مونوتریش نشان داد. ژن fliC  برای اولین بار به کمک PCR در دو جدایه باکتری جدا شده از گیاه زعفران تکثیر و مورد بررسی قرار گرفت. پرایمرهای اختصاصی طراحی شده بطور موثری توانستند این باکتری را از سایر گونه های دیگر تفکیک نمایند و به سرعت بنه های آلوده ی زعفران را از بنه های سالم تشخیص دهند. با استفاده از تصاویر میکروسکوپ الکترونی، تاژک از منظر نوع آرایش در دو جدایه باکتری جدا شده از گیاه زعفران مورد بررسی قرار گرفت. بررسی و مطالعه ژن fliC می تواند در تشخیص عامل بیماری پوسیدگی بنه زعفران مفید واقع شود.

    کلید واژگان: بورخولدریا گلادیولی, تاژک, درخت فیلوژنتیکی, فلاژلین, میکروسکوپ الکترونی
    Mohammad Ramezani Kaporchali, MohammadReza Safarnejad, Abolghasem Ghasemi, Naser Farrokhi *

    Burkholderia gladioli pv. gladioli (Bgg) is the causative agent of saffron bacterial rot. Accurate identification methods will play an important role in disease control management. Flagellum is the main commodity of the bacteria that facilitates its movement. Furthermore, it is of particular importance in colonization and pathogenicity. The fliC gene is one among five other genes encoding flagellin, the protein that makes the flagella in bacteria. In this study, the flagellin genes of 11 bacterial species were selected and the phylogenetic tree analysis divided them into plant and animal bacteria groups. Electron microscope images were taken from the bacterial flagella and its length was up to nine microns with 400-600 nm in diameter; as observed in both Lophotrichous and Monotrichous forms. fliC was amplified and analyzed for the first time by polymerase chain reaction for the two isolates of bacterial pathogen of saffron. Specific primers were designed and used that managed to separate Bgg from other bacteria, and helped in distinguishing the infected saffron corms from the healthy. Electron microscopy of the flagellum was illustrative of different types of Bgg. Investigating and studying the fliC gene can be useful in diagnosis of the causative agent of saffron corm rot disease.

    Keywords: Burkholdria gladioli, Electron Microscopy, flagella, flagellin, phylogenetic tree
  • هاشم کاظم زاده بنه، داود صمصام پور*، محمدرضا صفرنژاد، سید مهدی علوی
    هدف

    پروتیین خارج غشایی omp در سطح خارجی پیکره باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات (Candidatus Liberibacter asiaticus) وجود دارد. پروتیین مذکور می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید انواع آنتی بادی های مونوکلونال و پلی کلونال مورد استفاده قرار گیرد. با این حال خالص سازی پروتیین های غشایی به دلیل وجود ساختارهای آب گریز با مشکلات فراوانی همراه می باشد. در این راستا، هدف از اجرای پژوهش حاضر، بهینه سازی استحصال و تخلیص پروتیین نوترکیب omp می باشد.

    مواد و روش ها

    از سازه بیانی باکتریایی pET28a حاوی ژن omp برای تولید نوترکیب این پروتیین استفاده شد. بیان ژن  omp در سویه Rosetta باکتری  E. coli صورت پذیرفت. با توجه به آبگریز بودن پروتیین omp، خالص سازی آن در شرایط واسرشته  مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از غلظت های مختلف سدیم کلراید، اوره و گوانیدین هیدروکلراید در شرایط اسیدی pH  متفاوت استفاده گردید. به منظور دستیابی به پروتیین کاملا خالص نوترکیب، استحصال پروتیین از ژل پلی آکریل آمید با روش های مبتنی بر سونیکاسیون، شستشوی توسط انتشار و الکتروالوشن صورت پذیرفت. بررسی کمیت و کیفیت پروتیین های خالص شده با انجام الکتروفورز SDS-PAGE و محاسبه غلظت پروتیین با نرم افزار ImageJ  انجام گرفت. همچنین برای تایید ماهیت پروتیین خالص شده، آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی صورت پذیرفت.

    نتایج

    نتایج اولیه نشان داد که استفاده از غلظت 500 میلی مولار سدیم کلراید به عنوان یک جزء ضروری در بافرهای استخراج می باشد. همچنین استفاده از اوره به عنوان عامل دناتوره کننده کارایی دو برابری نسبت به گوانیدین هیدروکلراید در میزان پروتیین تخلیص شده داشت و بدین ترتیب بیشترین میزان پروتیین (450 میکروگرم در میلی لیتر) زمانی بدست آمد که غلظت 8 مولار اوره در اجزای بافری تخلیص گنجانده شد. علاوه بر این، نتایج مربوط به جداسازی باند پروتیین از ژل نشان داد که روش الکتروالوشن بهترین کارایی را در بازیابی و جداسازی پروتیین هدف از ماتریکس ژل در مقایسه با روش سونیکاسیون و شستشوی توسط انتشار داشت. نتایج آزمون الکتروفورز پروتیین حاکی از وجود یک پروتیین با اندازه 34 کیلو دالتون متناسب با وزن مولکولی پروتیین omp می باشد. آزمون وسترن بلات نیز موید ماهیت پروتیین نوترکیب در ممبران بود.

    نتیجه گیری

    مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از اوره با غلظت 8 مولار، نمک سدیم کلراید با غلظت 500 میلی مولار به همراه تنظیم بافر الوشن روی (4) pH در مرحله تخلیص پروتیین می تواند به عنوان یک شرایط بهینه برای بدست آوردن بیشترین مقدار پروتیین هدف بکار رود.  همچنین، روش الکتروالوشن به عنوان روش کارآمد جهت استحصال باند پروتیینی از روی ژل آکریل آمید معرفی شد.

    کلید واژگان: کلیدوژه, کلیدواژه
    Hashem Kazemzadebeneh, Davood Samsampour *, Mohammad Reza Safarnejad, Seyed Mehdi Alavi
    Objective

    The omp (Outer membrane protein) protein located at outer surface of the bacterial membrane body agent citrus greening disease (Candidatus Liberibacter asiaticus). The mentioned-protein can be used as antigen for generating polyclonal and monoclonal antibodies. Therefore, the purification of membrane proteins is exposed to many problems due to presence of hydrophilic structure. The purpose of this study was optimizing recovery and purification of the recombinant omp protein.

    Materials and Methods

    The pET28a bacterial expression construct containing omp gene was used to recombinant production of the mentioned-protein. The omp gene expression was conducted in E. coli strain Rosetta-Gami2. With considering to be hydrophilic of omp protein, its purification was investigated under denature condition. To attain it, the different concentrations of NaCL, urea and guanidine at the different acidity pH condition was applied. To obtain the pure omp recombinant protein, the protein recovery from polyacrylamide gel was performed by methods based on elution by diffusion, sonication, and electroelution. The evaluation of quality and quantity purified protein was analyzed by SDS-PAGE and the protein concentration was calculated by ImageJ software. Also, to validate the purified proteins, Western blot was applied by specific antibody.

    Results

    Primary results showed that using the 500 mM NaCL was detected as an essential share in purification buffers. Also, using urea as denature agent had twice the efficiency on the quantity of purified protein more than guanidine hydrocholoride and thus, when 8 m urea supplemented in purification buffer, the highest purified protein was attained (450 µl/ml). Furthermore, the results related to recovery the single band of protein from gel indicated that the electroelution has highest efficient on recovery of the target protein from gel matrix compared to sonication and elution by diffusion methods. The results of SDS-PAGE confirmed to appear a protein with 34 kDa related to molecular weight of target protein. Western blot validated the recombinant protein in membrane. 

    Conclusions

    The current study showed that using urea in 8 M, NaCL in 500 mM concentration in purification buffers following adjusting the elution buffer on pH (4) in elution purification step can be apply as an optimized condition to attain the highest target protein concentration. Furthermore, electroelution method introduced as efficient method in order to recovery band of the target protein from polyacrylamide gel matrix.

    Keywords: : Urea, Membrane protein, Protein purification, Guanidine hydrocholoride, Citrus greening, Recovery
  • سعید سهیلی وند*، امیر موسوی، محمدرضا صفرنژاد

    انتقال ژن به لیموترش (Citrus aurantifolia L.)، به عنوان یکی از گیاهان چوبی سرسخت، چالش برانگیز است. تاکید این مطالعه بر عوامل مهمی است که در افزایش موفقیت انتقال ژن و کاستن شیمری شدن شاخساره های تراریخته، موثر هستند. ریزنمونه های اپی کوتیل و میانگره، با سه سویه اگروباگتریوم (LBA4404، GV3101 و GV3850)، حامل پلاسمیدهای pBI121 و pCAMBIA3301 دارای ژن گزارشگر بتا گالاکتوزیداز (GUS)، جهت بررسی عوامل دخیل در انتقال ژن، استفاده شدند. فاکتورهای اصلی همچون OD600 اگروباکتریوم (3/0، 5/0 و 1)، زمان تلقیح ریزنمونه (5 ثانیه، 10 دقیقه و 30 دقیقه)، مدت هم کشتی (2 و 3 روزه) و انتخاب نوع و میزان عامل انتخابگرهای فسفینوترایسین (1، 3، 5 و 10 میلی گرم در لیتر) و کانامایسین (25، 50، 75 و 100 میلی گرم در لیتر) ارزیابی شدند. بدین منظور، بازدهی تراریختی با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز و میزان حالت شیمری شاخساره های تراریخته به کمک آزمون هیستوشیمیایی GUS، تایید گردیدند. نتایج نشان داد که اگروباکتریوم سویه LBA4404، با OD600 5/0 و زمان تلقیح پنج ثانیه برای اپی کوتیل و 10 دقیقه برای میانگره با هم کشتی دو روزه، مناسب ترین تیمارها برای هر دو ریزنمونه بودند. فراوانی انتقال ژن بین 93/0% در ریزنمونه میانگره روی محیط DKW حاوی 1 میلی گرم در لیتر فسفینوترایسین و 29/14 درصد، در ریزنمونه اپی کوتیل روی محیط DKW حاوی 50 میلی گرم در لیتر کانامایسین حاصل شد. همچنین مشخص گردید، به کار بردن سطوح بالای عامل انتخابگر، بازدهی تراریزش را با کاهش پدیده شیمری و جلوگیری از فرار شاخساره های غیرتراریخته، بهبود می بخشد. یافته های این مطالعه، راهکارهای موثری را در باززایی شاخساره های تراریخته غیرشیمری در لیموترش، ارایه می دهد.

    کلید واژگان: ژن گزارشگر GUS, اگروباکتریوم, نشانگر انتخابگر, بافت شیمر
    Saeed Soheilivand *, Amir Mousavi, Mohammadreza Safarnejad

    Sour lime (Citrus aurantifolia L.) is one of the most important woody plants is widely known for its recalcitrance to genetic transformation. We aimed herein to evaluate effective factors influencing the transformation efficiency and the reduction of chimeric transgenic shoots in sour lime. Epicotyl and internode explants were genetically transformed with different Agrobacterium tumefaciens strains e.g., LBA4404, GV3850, and GV3101, harboring the vectors pBI121 and pCAMBIA3301 containing β-glucuronidase (GUS) as a reporter gene. The effect of the following factors was evaluated: Agrobacterium concentration (OD600=0.3, 0.5 and 1), during inoculation (5 seconds, 10 minutes and 30 minutes), co-culture (2 and 3 days), and the selection regime (phosphinothricin at 1, 3, 5 and 10 mg/l and kanamycin at 25, 50, 75 and 100 mg/l). In following, transformation efficiency and the chimeric transgenic shoots rate were respectively confirmed by PCR and GUS assays. The results showed that Agrobacterium strain LBA4404, at the OD600 of 0.5, with 5 seconds (for epicotyl) and 10 minutes (for internode) inoculation at two-day co-culture period, were identified the most suitable treatments for both explants. The transformation frequencies ranged from 0.93% for internode on DKW medium containing 1.0 mg/l of phosphinothricin to 14.29% for epicotyl on DKW medium containing 50 mg/l of kanamycin. Inclusion of the high-level of selective treatments, improved the transformation rate through decreasing frequency escape and chimeric transgenic shoots. These findings provide novel insights into the appropriate procedure to constitute non-chimeric lime transgenic shoots.

    Keywords: GUS Reporter gene, Agrobacterium, selectable marker, chimeric tissue
  • ردیابی ویروس رگه ای توتون در مزارع سویای شمال ایران و ارزیابی واکنش ارقام سویا به ویروس در شرایط طبیعی مزرعه
    سمیرا شاملی، فرشاد رخشنده رو*، محمدرضا صفرنژاد، سیده ساناز رمضانپور
    ویروس رگه ای توتون (Tobacco streak virus, TSV) از جنس آیلارویروس ها، ویروسی چندبخشی، تک رشته، RNA مثبت، با دامنه میزبانی وسیع است که خسارت آن در بسیاری از محصولات زراعی گزارش شده و به عنوان عامل سوختگی جوانه های سویا معرفی شده است. در این پژوهش، تعداد 470 نمونه سویا با علایم زردی، موزاییک، تغییر شکل، نکروز و کلروز، و کوتولگی از مزارع استان های گلستان و مازندران جمع آوری و میزان آلودگی نمونه ها بهTSV، توسط آزمون الایزای مستقیم و سپس واکنش زنجیره ای پلیمراز با آغازگر اختصاصی ویروس تعیین گردید. نتایج ردیابی ویروس بیانگر آلودگی 3/9 درصدی استان گلستان و 2/6 درصدی استان مازندران بود. تعدادی از نمونه های سویای دارای آلودگی به TSV در میزبان تک لکه Chenopodium quinoa مایه زنی گردید و از Nicotiana benthamiana و Datura stramonium جهت تکثیر ویروس استفاده شد و به عنوان منبع ویروس در گلخانه نگهداری گردید. به دلیل عارضه اختلال در غلاف بندی سویا در شمال کشور و تاثیر احتمالیTSV بر بروز عارضه، جهت بررسی واکنش ارقام مختلف سویا به TSV در شرایط طبیعی و ارزیابی نقش احتمالی این ویروس در عارضه اختلال سویا، آزمایشی در قالب طرح اسپیلت پلات با سه فاکتور مایه زنی ویروس، استفاده از توری جهت جلوگیری از فعالیت آفات و ناقلین، و ارقام مختلف سویا اجرا شد. براساس نتایج، مایه زنی TSV سبب ایجاد زردی و کوتولگی بوته ها گردید و کاهش معنی دار ارتفاع بوته، تعداد غلاف، وزن خشک و تر بوته ها و عملکرد در تیمارهای مایه زنی شده با TSV مشاهده شد، اما علایم خاص عارضه اختلال در تیمارهای مایه زنی شده با TSV مشاهده نگردید. بیش ترین و کم ترین شاخص های رشدی بوته های سویا به ترتیب در تیمار عدم مایه زنی ویروس به همراه استفاده از توری، و تیمار مایه زنی ویروس و عدم استفاده از توری مشاهده شد.
    کلید واژگان: سویا, TSV, واکنش ارقام, عارضه اختلال
    Detection of Tobacco Streak Virus in Soybean in North of Iran and Evaluation of Soybean Cultivars Response to TSV in Natural Field Condition
    Samira Shameli, Farshad Rakhshandehroo *, Mohammadreza Safarnegad, Seyede Sanaz Ramezanpoor
    Tobacco streak virus (TSV) belonging to the genus Ilarvirus, is a multipartite single-stranded, positive-sense RNA virus with an extensive host range, that its damage has been reported in many crops and is introduced as a causal agent of soybean bud blight. In this study, 470 samples of soybean were collected from Golestan and Mazandaran provinces with yellowing, mosaic, leaf distortion, necrosis, chlorosis, and stunting symptoms. TSV infection of samples was tested by DAS-ELISA method and polymerase chain reaction (PCR) with specific designed primers. Results showed 9.3% and 6.2% TSV incidence for Golestan and Mazandaran provinces, respectively. Extract of infected plants was inoculated in Chenopodium quinoa and propagated in Nicotiana benthamiana and Datura stramonium and maintain in greenhouse as a source of virus. Because of soybean podding disorder in north of Iran and possible role of TSV in disorder, for evaluation of soybean cultivars response to TSV, a field experiment was conducted in a split plot design with three factors, virus inoculation, using net for prevent pest activity, and cultivars. Based on the result, TSV infection caused yellowing and stunting, and significant reductions in final height, number of nod, fresh and dry weight, and yield were observed in plants that inoculated by TSV but specific symptoms of disorder did not seen. The highest and lowest plant growth indices were seen in no virus inoculation plus use of net, and virus inoculation plus no use of net treatments, respectively.
    Keywords: Soybean, TSV, Cultivars response, Disorder
  • ساجده کریم پور، غلامحسین داوری نژاد*، محمد زکی عقل، محمدرضا صفرنژاد

    بهینه سازی پروتکل های ریزازدیادی با اهداف تجاری و اصلاحی انجام می گیرد. امروزه تکنولوژی های کامپیوتری روش های جدیدی برای درک بهتر نقش عوامل درون شیشه ای در رشد گیاهان فراهم آورده است. به منظور بهینه ساختن تنظیم کننده های رشد (BA، IBA و GA3) در پرآوری سیب رقم ʼعباسیʽ آزمایشی با سه فاکتور با استفاده از نرم افزار Design Expert و در قالب 20 نقطه طراحی و اجرا گردید. آزمایش ریشه دهی در قالب طرح کاملا تصادفی با 8 ترکیب اکسین (IBA + NAA) اعمال گردید. تعداد شاخه باززایی شده (5-3/0 شاخه به ازای ریزنمونه) به صورت خطی و مثبت تحت تاثیر فاکتور BA (5/2-5/0 میلی گرم بر لیتر) قرار گرفت درحالی که پاسخ تعداد برگ (33/14-67/1 برگ به ازای شاخه تولید شده) به صورت خطی و منفی متاثر از BA (5/2-5/0 میلی گرم بر لیتر) بود. اثر GA3 (5/0-0 میلی گرم بر لیتر) بر پاسخ طول شاخه (32/1-07/0 سانتیمتر) به صورت خطی و منفی دیده شد. درصد شاخه های غیر نرمال (100-01/0 درصد) در قالب مدل چندجمله ای درجه دوم تحت تاثیر هر سه فاکتور BA(5/2-5/0 میلی گرم بر لیتر) ، IBA (5/0-0 میلی گرم بر لیتر) وGA3 (5/0-0 میلی گرم بر لیتر) قرار گرفت بدین صورت که به صورت خطی و مثبت تحت تاثیر BA قرار داشت و به صورت درجه دوم مثبت و منفی به ترتیب از IBA و GA3 تاثیر گرفت. مطابق نتایج این آزمایش غلظت بهینه برای BA، IBA و GA3 به ترتیب 5/1، 1/0 و 02/0 میلی گرم بر لیتر می باشد که باعث تولید شاخه هایی با نرخ پرآوری 5/2 شاخه به ازای ریز نمونه، طول شاخه 9/0 سانتیمتر، 3/4 عدد برگ به ازای هر شاخه تولیدشده و 4 درصد شاخه های غیر نرمال می شود. درصد نکروزه شدن نوک شاخه متاثر از فاکتورهای مورد ارزیابی نبود. در ریشه دهی ریزشاخه ها، NAA از IBA موثرتر بود و بالاترین درصد ریشه دهی با کاربرد 1 و سپس 5/0 میلی گرم بر لیتر NAA (به ترتیب 86/73 و 66 درصد) به دست آمد.

    کلید واژگان: ریز ازدیادی, نرم افزار Design Expert, GA3, IBA, Malus domestica Borkh
    Sajede Karimpour, Gholamhossein Davarynejad *, Mohammad Zakiaghl, MohammadReza Safarnejad

    Optimization of medium components because of being multifactors is very difficult. In order to optimize the plant growth regulators (BA, IBA and GA3) for shoot proliferation of apple cv. ‘Abbasi’ a three-factors experiment was designed and performed in 20 points using Design Expert software according response surface method. A completely randomized design (CRD), based on eigth auxin combinations (IBA+NAA), also were performed for in vitro rooting of microcuttings. Proliferated shoot number was linearly and positively affected by the BA factor, while the response to the leaf number was linearly and negatively affected by BA. The effect of GA3 on proliferated shoot length response was observed in negatively linear model. The abnormal shoot percentage in a quadratic model was influenced by all three factors, BA, IBA and GA3; positively linear by BA, positively quadratic by IBA, and negatively quadratic by GA3. According to the results of this experiment, the optimum concentrations for BA, IBA and GA3 were 1.5, 0.1 and 0.02 mg L-1, respectively, which resulted proliferate shoots with a rate of 2.5 shoots per explant, with 0.9 centimeters in length, 4.3 leaves per shoot, and 4% of abnormal shoots. The percentage of shoot-tip necrosis was not affected by the evaluated factors. NAA was more effective than IBA for rooting of microcutings, and medium aupplelment with 1 mg L-1 IBA or 0.5 mg L-1 NAA can be used successfully for rooting of apple cv. ʽAbbasiʼ shoots in vitro.

    Keywords: BA, Design Expert software, GA3, IBA, Malus domestica, Borkh
  • ساجده کریم پور، غلامحسین داوری نژاد*، محمد زکی عقل، محمدرضا صفرنژاد

    بمنظور بهبود رشد شاخه های باززایی شده گلابی رقم شکری آزمایشی در فضای نرم افزار Design Expert در قالب 20 نقطه شامل مقادیر تصادفی از سه فاکتور عناصر غذایی (NH4NO3، آهن و عناصر میکرو) اجرا شد. پاسخ ریزنمونه ها از نظر تعداد شاخه پرآوری شده، طول شاخه پرآوری شده، تعداد برگ ، مقدار کلروفیل a برگ، کارتنوئید برگ و قدرت رشدی بعد از دو ماه ثبت گردید. فاکتورهای مورد بررسی در قالب مدل های حاصل از تجزیه آماری (مدل های خطی، چندجمله ای ساده و چند جمله ای درجه دوم) بر پاسخ های مورد ارزیابی بطور معنی داری موثر بودند. افزایش آهن تا یک و نیم برابر و کاهش NH4NO3 به نصف غلظت آن ها در محیط کشت MS باعث افزایش تعداد شاخه پرآوری شده (43/4 برابر) گردید. NH4NO3، آهن × عناصر میکرو رابطه ی خطی منفی با طول شاخه نشان دادند درحالیکه تعداد برگ بطور منفی متاثر از عناصر میکرو بود. با افزایش NH4NO3 از طول شاخه پرآوری شده کاسته شد و از طرف دیگر مقادیر 5/0× و1× محیط کشت MS به ترتیب برای آهن و میکرو باعث افزایش 5/1 برابری در طول شاخه شد. شاخه های رشد یافته در محیط کشت حاوی 1× مقادیر میکرو در محیط کشت پایه MS به میزان 5/1برابر برگ بیشتری نسبت به مقادیر 2× تولید کردند. محتوی کلروفیل a و کارتنوئید برگ در قالب مدل خطی تحت تاثیر مقادیر آهن (مثبت) و NH4NO3 (منفی) قرار گرفتند. افزایش آهن تا 5/1× برابر و کاهش NH4NO3 تا 5/0× برابر محیط کشت پایه MS باعث افزایش 2 برابری در میزان کلروفیل a و کارتنوئید شد. NH4NO3 و میکرو در قالب رابطه خطی منفی رشد رویشی را تحت تاثیر قرار دادند بطوریکه نصف مقادیر NH4NO3 با افزایش تعداد شاخه پرآوری شده و طول شاخه موجب افزایش قدرت رشدی شاخه تا 5/2 برابر شاهد گردید و کاهش مقادیر میکرو از طریق افزایش طول شاخه بر قدرت رشدی تاثیر مثبت داشت. محیط کشت بهینه شده برای گلابی شکری با استفاده از نرم افزار Design Expert  محیط کشت MS تغییر یافته به ترتیب حاوی 9/0×، 1× و 5/0× مقادیر آهن، میکرو و NH4NO3 بود.

    Sajede Karimpour, Gholamhossein Davarynejad*, Mohammad ZakiAghl, Mohammadreza Safarnejad
    Introduction

    Micropropagation is important for both multiplication and preservation of a wide range of nursery plants, including many fruit crops. A number of studies exist on optimization of growth in in vitro condition for one or two cultivars, but often these results cannot be used for the other genotypes because individual cultivars may differ greatly in their requirements. Therefore, genotype-specific medium are usually empirically developed for many plants including pear. Pear cultivars and species are often recalcitrant to tissue culture manipulations and Murashige and Skoog (23) (MS) basal nutrient medium at full or half strength or with slight modifications is the most media were used. The QL, DKW, and WPM media are also used and they differ mostly in types or amounts of calcium and nitrogen in compared with MS. Developing growth media for specific and unique cultivars is complex and time-consuming. Currently, improved experimental design and using statistical softwares allow much more efficient approaches to be utilized for the improvement of micropropagation media and conditions. Improving of growth medium for in vitro propagation of plants depends on type and quantities of mineral nutrients and plant growth regulators as important ones. The existence of statistical softwares to manage effective factors is very needed to access an optimized growth medium for in vitro propagation of plants. Design Expert is used as auxiliary software to identify essential factors in in vitro culture. Since the in vitro proliferation parameters of Pyrus communis cv. ʽShekariʼ need to optimize for growth better, we were designed and performed a multifactor surface response experiment by Design Expert software to following two goals. First, to find optimized amount of some elements in medium and second, to show the response surface method can be useful for improving in vitro culture.

    Materials and Methods

    One experiment was designed by Design Expert software and was performed to improve in vitro proliferated shoots of Pyrus communis cv. ʽShekariʼ. Shoots were grown in a modified MS medium (supplement with 1 mg l-1 of N6-benzyladenine) were used for this experiment. The experiment was included 20 model points randomly based on three nutritional factors: NH4NO3 (0.5-1.5×), Fe (0.5-1.5×) and micro nutrients (1-2×) in different concentration of their MS amounts. Media enriched with sucrose (30 g l-1) and agar (8 g l-1) after pH adjustment at 5.7. Cultures were grown at 25°C under a 16-h photoperiod with 70–90 μM m-2 s-1 irradiance provided by a combination of cool- and warm-white fluorescent bulbs and were transferred to new medium every 3 weeks. Several responses were recorded after two months: Proliferated shoot number, proliferated shoot length (cm), total leaf number, leaf chlorophyll a (mg g-1), leaf carotenoids (mg g-1), and vegetative growth (cm). Responses for each point were the mean of 5 replicates. Experimental design, model evaluation, and analysis were done by Design-Expert® 8 (2010) software and the highest-order polynomial model that was significant for each response was used for ANOVA.

    Results and Discussion

    Factors statistically were significant for responses according to ANOVA in linear, 2FI and quadratic models. Reduced NH4NO3 (×0.5) and enhanced Fe (×1.5) induced the higher number of proliferated shoots up to 4.43 folds of control according a quadratic model. NH4NO3 and Fe×Micro had negative liner relationships with shoot length, while leaf number negatively was affected by micros. Fe and NH4NO3 were effective factors on leaf chlorophyll a and carotenoids contents. Increasing Fe (×1.5) and decreasing NH4NO3 (×0.5) led to 2 folds higher production of chlorophyll a and carotenoids. Vegetative growth of Pyrus communis cv. ʽShekariʼ  in a quadratic-order method (negatively controlled by NH4NO3 and micros) increased by high values of proliferated shoot number and shoot length induced by reduced NH4NO3 (×0.5). Optimized amount of three studied factors based on two important responses, maximum amount of proliferated shoot number and length, were 0.9, 1 and 0.5× for Fe, micro and NH4NO3 in MS medium, respectively.

    Conclusions

    Design Expert software and response surface method were used successfully for in vitro optimizing of Pyrus communis cv. ʽShekariʼ regenerated shoots. Fe, Micro and NH4NO3, were the effective factors for shoot regeneration responses in linear, 2FI and quadratic models. The multifactor investigation in surface response design will enable us to predict an optimal medium for several effective factors and estimate suitable responses. Outputs of these types of experiments provide a suitable background to increase optimization accuracy for future experiments.

    Keywords: In vitro propagation, Pear, Response surface method, Micro, Fe
  • مهدی آزادوار*، حمیدرضا علیزاده، موسی نجفی نیا، محمدرضا صفرنژاد، صمد اسفندیاری

    بیماری نوظهور مرگ ناگهانی درختان مرکبات طی سال های اخیر تعداد زیادی از درختان مرکبات با پایه بکرایی در جنوب استان کرمان را از بین برده است. این بیماری ناشی از همراهی باکتری Candidatus Liberibacter asiaticus است و عوامل دیگری از جمله آلودگی هم زمان به بیمارگرهای خاکزی یا  Ca. Phytoplasma aurantifolia و وجود تنش های گرمایی و خشکی سبب تشدید بیماری و بروز زوال در این درختان می شود. استفاده از نهال سالم و گواهی شده، استفاده از پایه نارنج یا ولکامرلمون بجای بکرایی و لیموترش، مبارزه با حشرات مکنده هم زمان با بروز جست های جدید، تغذیه مناسب، آبیاری بهینه و با توزیع مناسب بویژه در فصل تابستان، مبارزه با نماتدها و قارچ های بیمارگر خاکزی، خودداری از ایجاد هرگونه تنش در گیاه و هرس مناسب از جمله اقداماتی است که برای پیشگیری و مدیریت بیماری مرگ ناگهانی درختان مرکبات در جنوب استان کرمان توصیه می شود.

    کلید واژگان: بکرایی, زوال, فیتوپلاسما, Liberibacter
    Mehdi Azadvar*, Hamidreza Alizadeh, Mousa Najafinia, Mohammadreza Safarnejad, Samad Esfandiari

    During recent years, the newly emerging disease, citrus sudden decline (CSD) has destroyed many of citrus trees grafted onto bael rootstock in the south of Kerman Province. The disease is caused by Candidatus Liberibacter asiaticus and its simultaneous infection to soil born pathogens or Ca. Phytoplasma aurantifolia, or heat and drought stresses can increase the disease severity and appearance of the decline symptoms. Using the healthy and certified rootstock, using the Sour Orange or Volkamer Lemon as rootstock, control of the sucking insects at the time of flushing, optimum irrigation with appropriate distribution especially during the summer season, control of soil born fungi and nematodes, avoiding stress to plant and appropriate pruning are recommended for prevention and management of CSD disease in the south of Kerman Province.

    Keywords: Bael, Decline, Liberibacter, Phytoplasma
  • مدل سازی برهم کنش نوکلئوکپسید پروتئین نوترکیب عامل اصلی بیماری موزائیک انجیر، با آنتی بادی مونوکلونال به روش های In silico
    مرتضی شاه میرزائی، فرشاد رخشنده رو*، محمدرضا صفرنژاد، حمیدرضا زمانی زاده، توفیک البیانو

    امروزه مهندسی آنتی بادی یک رویکرد مهم در طراحی و ساخت آنتی بادی های تشخیصی و درمانی است. مطالعه برهم کنش میان آنتی بادی و آنتی ژن گامی مهم در طراحی آنتی بادی هایی با ویژگی های مطلوب و موردنظر است. در این راستا، روش های مطالعاتی In silico یک ابزار سودمند جهت بررسی ویژگی های ساختاری و تعاملات بین مولکولی است. درواقع Docking (جایابی لیگاند) فرآیند پیش بینی تعاملات و ترکیبات جفت شوندگی و آنتالپی اتصال مجموعه های آنتی ژن-آنتی بادی است. در این مطالعه ساختارهای سه بعدی نوکلیوکپسید پروتیین ویروس موزاییک انجیر Fig mosaic emaravirus (FMV)  به عنوان آنتی ژن و هم چنین آنتی بادی به صورت قطعات متغیر تک زنجیره ای scFv علیه این آنتی ژن که از طریق تکنیک نمایش فاژی جداسازی شده بود، توسط نرم افزار تحت وب I-TASSER به دست آمد. پس از آن ساختارهای مجموعه های متصل شونده آنتی ژن-آنتی بادی و هم چنین شبیه سازی دینامیکی مولکول ها با انجام فرآیند داکینگ مولکولی توسط نرم افزار Hex صورت پذیرفت. با تجزیه وتحلیل مجموعه های متصل شونده آنتی ژن-آنتی بادی FMVNp-scFv، آمینواسیدهای دخیل در برهم کنش این مجموعه ها شناسایی گردید. نتایج نشان داد که تمام این اسیدهای آمینه ها متعلق به نواحی فوق متغیر (CDR) بودند. درمجموع نتایج حاصل از این مطالعه بیوانفورماتیکی می تواند در طراحی و توسعه آنتی بادی های جدید با گیرایی بالاتر در تشخیص ویروس موزاییک انجیر کمک نماید.

    کلید واژگان: آنتی بادی FMVNp-scFv, نرم افزار I-TASSER, نرم افزار Hex, همولوژی مدلینگ, داکینگ مولکولی
    Modeling Study on the Interaction Between Recombinant Nucleocapsid Protein of the Main Causal Agent of Fig Mosaic Disease with Monoclonal Antibody by In Silico Methods
    Morteza Shahmirzaie, Farshad Rakhshandehroo *, Mohammadreza Safarnejad, Hamidreza Zamanizadeh, Toufic Elbeaino

    Nowadays, antibody engineering is an important approach to design and generate of therapeutic and diagnostic antibodies. The study of the interactions between antibodies and antigens is a critical step in the design of antibodies with desired properties, In silico docking analyzes is a useful tool for structural characterization of bimolecular interactions. Docking is the process of predicting bound conformations and binding enthalpy of antibody–antigen complexes. In this study, the three-dimensional structures of FMV nucleocapsid protein as an antigen as well as monoclonal antibody in form of scFv which was selected against the antigen by Phage display technique were built by I-TASSER software and then the binding complexes and molecular dynamics (MD) simulations were done by Hex software. By analyzing of the FMVNp-scFv complexes, important amino acids involved in antigen–antibody interactions were identified which all of them were belong to the CDRs. In conclusion, results obtained from this bioinformatics study could be helpful to design and development of the new antibodies with high affinities for FMV diagnosis.

    Keywords: FMVNp-scFv antibody, I-TASSER software, Hex software, Homology modeling, Molecular docking
  • حمیده رئیسی، ناصر فرخی *، سیدمهدی علوی، محمدرضا صفرنژاد، سیدعلی الهی نیا، فرشید شریفیان، حسین صفرپور
    Hamideh Raeisi, Mohammad Reza Safarnejad*, Seyed Mehdi Alavi, Naser Farrokhi, Seyed Ali Elahinia, Hossein Safarpour, Farshid Sharifian

    The Xanthomonas citri pv. citri (Xcc) is causal agent of bacterial citrus canker which is major disease of citrus throughout the world. The pthA bacterial effector protein is presented within the infected plants and indispensable of canker. The scFv antibodies are valuable tools for diagnosis and suppression of pathogens within plants. The present article describes developing and characterization of specific recombinant monoclonal scFv antibodies against pthA effector protein. For this aim, the gene encoding pthA protein was heterologously expressed in Escherichia coli and used for screening of Tomlinson phage display antibody library to pinpoint specific single chain variable fragment (scFv). In each round of panning, the affinity of phage towards pthA was checked by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The data was indicative of about 50% of the monoclonal phages to be reactive strongly against pthA protein. Among the positive clones, 5 samples (A12, B8, C1, H8 and G8) were capable of detecting Xcc-infected plant samples and recombinant pthA protein. Restriction fragment length polymorphism showed similar banding pattern for all 5 scFvs as renamed to pthA-scFG8. HB2151 E. coli cells were infected by the phage bearing pthA-scFG8, and the expression of the peptide was induced by IPTG to produce a 30 kDa recombinant molecule. I-TASSER was used for homology modeling of both scFv and pthA and docking was carried out by Hex program. The latter demonstrated binding energy of −784 kcal/mol in scFv-pthA.

    Keywords: Biopanning, citrus bacterial canker, phage display, single chain fragment variable
  • مهدی آزادوار، حمیدرضا علیزاده*، محمدرضا صفرنژاد، موسی نجفی نیا، پیرو بیانکو
    عارضه نوظهور زوال سریع در سال های اخیر سبب مرگ تعداد زیادی از درختان مرکبات با پایه بکرایی در جنوب استان کرمان شده است. علائم این بیماری به صورت پژمردگی برگ ها، پوسیدگی ریشه ها و مرگ سریع درختان مشاهده می شود. این پژوهش با هدف شناسایی عوامل بیماری مذکور انجام شد. حضور پروکاریوت های بیماری زای گیاهی با انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای عمومی و اختصاصی و هم چنین با استفاده از سامانه Miseq بررسی شد. ردیابی ویروس ها و ویروئیدها با استفاده از آزمون های ELISA، RT-PCR و مایه زنی به گیاهان محک و همچنین جداسازی dsRNA از نمونه های گیاهی انجام شد. همراهی نماتد Tylenchulus semipenetrans و شبه قارچ Phytophthora nicotiana با جداسازی و ارزیابی جمعیت این بیمارگرها در ریشه و ریزوسفر درختان بیمار و مقایسه آن با درختان بدون علائم بررسی شد. درمجموع، نتایج این پژوهش نشان دهنده همراهی Candidatus Liberibacter asiaticus با بیماری زوال سریع درختان مرکبات با پایه بکرایی در جنوب استان کرمان است. به علاوه وجود تنش های خشکی و دمایی و آلودگی هم زمان درختان بیمار به Ca. Phytoplasma aurantifolia، شبه قارچ Phytophthora nicotiana و نماتد Tylenchulus semipenetrans می تواند منجر به تشدید بیماری و تسریع در زوال درختان شود.
    کلید واژگان: بکرایی, پوسیدگی ریشه, فیتوپلاسما, لیبری باکتر
    Mehdi Azadvar, Hamidreza Alizadeh *, Mohammad Reza Safarnejad, Mousa Najafinia, Piero Atellio Bianco
    The emerged citrus quick decline disease has destroyed many of citrus plants grafted onto Bakraee rootstock in southern Kerman during recent years. Disease symptoms are included leaf wilting, root rot, and quick decline. In this project, the etiology of quick decline disease was studied. Symptomatic and asymptomatic plants were tested for the presence of plant pathogenic prokaryotes using PCR with universal and specific primers, and Miseq Illumina method. Furthermore, ELISA, RT-PCR, inoculation on index plants, and dsRNA extraction were used for detection of viruses and viroids in symptomatic and asymptomatic plants. The correlation between the presence of Tylenchulus semipenetrans, Phytophthora nicotiana, and quick decline disease was investigated by isolation and quantification of pathogens from root and rhizosphere of asymptomatic and infected plants. Overall, results indicated the association of Candidatus Liberibacter asiaticus with citrus (on Bakraee rootstock) quick decline disease in southern Kerman. In addition, drought and heat stresses and co-infection of the diseased plants by Ca. Phytoplasma aurantifolia, Phytophthora nicotiana, and Tylenchulus semipenetrans lead to severe symptoms of the disease and accelerated the decline of the infected plants.
    Keywords: Bakraee, Greening, liberibacter, phytoplasma, root rot
  • Mohammad Reza Safarnejad*, Kaveh Bananej, Yalda Sokhansanj
    The legume crops such as chickpea and lentils are mainly cultivated in semi-arid tropical lands. Chickpea chlorotic dwarf virus (CpCDV) causes major losses to legumes throughout the world. Producing of specific antibody against this virus is crucial for surveys of disease in the fields and assessment of vial resistance in plant cultivars. Present article describes developing of specific antibody against the CpCDV virus by applying recombinant protein. In this study, coat protein of CpCDV was selected as a target for detection and preparation of polyclonal antibody. To achieve this aim CP gene encoding coat protein of CpCDV was initially PCR-amplified and inserted into bacterial expression vector. Expression of recombinant protein was performed in Bl21 strain of Escherichia coli. Purification was carried out under native conditions and the accuracy of recombinant protein production was confirmed by electrophoresis. The purified recombinant coat protein of CpCDV was used for immunization of rabbit. Purification of immunoglobulin molecules was performed by affinity chromatography using protein A column followed by conjugating of IgG to alkaline phosphatase enzyme. The capability of purified antibodies and conjugates for efficient detection of infected plants was assessed by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA), western blotting and dot immunosorbent assay (DIBA). These results proved that prepared IgG and conjugate are able to distinguish with high efficiency CpCDV infected plants. To the best of our knowledge, this is the first report for production of anti-CpCDV antibodies raised through recombinant protein technology.
    Keywords: antibody, chickpea, CpCDV, ELISA, recombinant protein
  • سمیرا شاملی، فرشاد رخشنده رو *، محمدرضا صفرنژاد، سیده ساناز رمضانپور
    ویروس مخطط توتون (Tobacco streak virus) یکی از مهم ترین ویروس های مخرب محصولات زراعی بوده و به عنوان عامل سوختگی جوانه های سویا در نقاط مختلف دنیا گزارش شده است. در این پژوهش، واکنش ارقام رایج سویا در شمال کشور نسبت به این ویروس و تاثیر احتمالی آن بر غلاف بندی سویا در شرایط گلخانه ارزیابی گردید. پژوهش به صورت طرح کاملا تصادفی در قالب فاکتوریل با دو تیمار جدایه های ویروس (جدایه های سویا، ماش و آفتابگردان) و ارقام سویا (ویلیامز، امیر، کتول، سامان، ساری) در 3 تکرار انجام شد. برای اثبات آلودگی بوته ها از آزمون الایزای مستقیم با استفاده از آنتی سرم چند همسانه ای TSV و واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ویروس استفاده گردید. نتایج نشان داد جدایه های ویروس به طور معنی داری باعث کاهش ارتفاع بوته ها، کاهش تعداد گره ها ، کاهش تعداد غلاف های سالم وافزایش غلاف های بدفرم شدند. ارقام نیز دارای تاثیرمعنی دار برشاخص های رشدی ارتفاع بوته ، تعداد گره ، تعداد غلاف های بدفرم، و وزن تر بوته ها بودند. کمترین میزان تفاوت شاخص های رشدی و میزان اختلال در غلاف بندی نسبت به نمونه شاهد در رقم ویلیامز و بیشترین اختلال در ارقام امیر و کتول مشاهده گردید. شدت علایم ایجاد شده توسط جدایه سویا بیشتر از دو جدایه ماش و آفتابگردان بود. نتایج حاکی از تاثیر معنی دار جدایه های ویروس و ارقام در غلاف بندی سویا بود.
    کلید واژگان: ویروس مخطط توتون (TSV), سویا, اختلال در غلافبندی, گلخانه
    Samira Shameli, Farshad Rakhshandehroo*, Mohammadreza Safarnejad, Seyedeh Sanaz Ramezanpoor
    Tobacco streak virus is one of the most important destructive viruses of crops, and reported to be as a causal agent of soybean bud blight worldwide. In this study, the response of common soybean cultivars to TSV and its possible effect on soybean podding under greenhouse conditions was evaluated in the north of the country.This research was carried out in two way factorial arrangement on a CRD (completely randomized design) with virus isolates (soybean, mungbean and sunflower isolates) and soybean cultivars (Williams, Amir, Katol, Saman, Sari) as treatments in 3 replications. Using with the DAS-ELISA method and polyclonal antibody specific for TSVand polymerase chain reaction (PCR) and designed primers specific for virus, plants were tested for TSV infection. Results showed that viral isolates significantly reduced the plant length, number of nodes, number of healthy pods and increased disorder pods. In addition to the growth indices (plant length, number of nodes, pod states, dry weight and fresh weight), viral infection had a significant effect on the numbers of disorder pods in different cultivars.The lowest differences in growth indices and podding disorder observed in Williams cultivar whereas most podding disorder seen in Amir and Katol cultivars. The symptoms caused by soybean virus isolates were more severe than mungbean and sunflower isolates of the virus. Results indicated to the significant effect of viral isolates and soybean cultivars on podding disorder.
    Keywords: Tobacco streak virus (TSV), Soybean, disorder in podding, Greenhouse
  • سعید سهیلی وند، امیر موسوی*، محمدرضا صفر نژاد، ناصر فرخی، مسعود توحید فر، محسن مردی، سید مهدی علوی
    در این تحقیق، پیوند ex vitro، برای نجات شاخساره های بدون ریشۀ ناشی از کشت بافت و انتقال ژن لیموترش (Citrus aurantifolia L.) ، انجام و تاثیر عامل های مختلفی مانند نوع و اندازۀ پیوندک، نوع پیوند، شرایط نگهداری گیاهچه های پیوندی و استفاده از محیط کشت غذایی در اطراف محل پیوند، بررسی شد. نتایج نشان داد، بهترین بازدهی با استفاده از روش متداول پارافیلم پیچی، در شرایط محیطی کنترل شده و با اندازه های پیوندک بزرگ تر و چوبی تر به دست می آید. تزریق محلول غذایی در محل پیوندک، در میزان موفقیت پیوند، تفاوت معنی داری با شاهد نشان نداد. ولی کاربرد محیط غذایی MS آگاردار در محل پیوند، در مقایسه با پارافیلم پیچی، موفقیت ریزپیوندی ex vitro را بالا برد و نشان داد، می تواند به عنوان نگه دارندۀ پیوندک روی پایه، محافظ رطوبت پیوندک و تامین کنندۀ مواد غذایی آن، در روزهای اولیه عمل کرده و در سازگاری تدریجی پیوندک به محیط in vivo کمک کند.
    کلید واژگان: پایه, پیوند انتهایی و جانبی, پیوندک, شاخساره, کشت بافت
    Saeed Soheilivand, Amir Mousavi *, Mohammadreza Safarnegad, Naser Farrokhi, Masoud Tohidfar, Mohsen Mardi, Seyed Mehdi Alavi
    This study was carried out to evaluate factors affecting ex vitro micrografting of sour lime (Citrus aurantifolia L.) such as size and type of scions, grafting type, micrografted plantlets conditions and usage of nutrient medium, in order to rescue rootless shoots developed form tissue culture or genetically transformed shoots. Our results showed that the optimum efficiency was achieved when bigger and woodier scions were used in conventional grafting method under controlled environmental conditions. Furthermore, soluble nutrients injected into the micrograft did not show significant difference compared with the control. However, the number of successfully ex vitro micrografted explants treated with MS medium containing agar was higher than the parafilm covered micrografted explants. MS medium supplemented with agar can act as an additional nutritional source to the micrografted explants during the early days of micrografting. Moreover, it gives better anchorage and humidity support for scions and helps with the gradual acclimatization of them in in vivo conditions.
    Keywords: Cleft, side grafting, scion, shoot, stock, tissue culture
  • مرتضی شاه میرزایی، فرشاد رخشنده رو، محمدرضا صفرنژاد *، حمیدرضا زمانی زاده، توفیک البیانو
    ویروس موزائیک انجیر Fig mosaic emaravirus (FMV)یکی از مهم ترین عوامل ایجاد کننده بیماری موزائیک انجیر می باشد. این تحقیق به منظور شناسایی و ردیابی FMV در مناطق مختلف کشور و همچنین مطالعه روابط تبارزایی بر مبنای ژن کد کننده پروتئین نوکلئوکپسید (NP) صورت پذیرفت. برای این منظور تعداد 54 نمونه برگ انجیر دارای علایم موزائیکی و کلروز از مناطق مختلف کشت انجیر در شمال، مرکز و جنوب ایران جمع آوری گردید. ردیابی اولیه از طریق آزمون الیزا با استفاده از آنتی بادی اختصاصی ویروس FMV انجام گرفت. آزمون RT-PCR به منظور تائید نتایج ردیابی اولیه با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن (NP) صورت پذیرفت. همسانه سازی، تعیین توالی نوکلئوتیدی و رسم درخت تبارزایی 14 جدایه منتخب از مناطق جغرافیایی مختلف انجام گرفت. نتایج ردیابی سرولوژیکی و آزمون مولکولی حاکی از میزان 5/55٪ آلودگی در نمونه های مورد بررسی بود. نتایج مطالعات تبار زایی نشان داد که تمامی جدایه های مربوط به مناطق شمال و مرکز کشور به همراه جدایه های گزارش شده از سایر کشورها در گروه I قرار می گیرند در حالی که جدایه های استان فارس (استهبان و جهرم) در یک گروه تبارزایی جدا، گروه II، دسته بندی شدند. نتایج حاصله حاکی از وجود ارتباط معنی داری بین شدت علایم و گروه بندی تبارزایی می باشد. جدایه جهرم، JA2، از گروه II با داشتن بیشترین میزان تفاوت با سایر جدایه های کشور و دنیا، بنظر می رسد که دارای خصوصیات بیماری زایی و بیولوژیکی منحصر بفردی باشد که تعیین این خصوصیات در مطالعات تکمیلی ضروری می باشد.
    کلید واژگان: تبارزایی, نوکلئو کپسید پروتئین, ویروس موزائیک انجیر, DAS, ELISA, RT, PCR
    M. Shahmirzaei, F. Rakhshandehroo, M. R. Safarnejad *, H. R. Zamanizadeh, Toufic Elbeaino
    Fig mosaic emaravirus (FMV)is considered as one of the main causal agents of Fig Mosaic Disease complex (FMD). In order to detection and identification of FMV in different regions of Iran and better understanding of the phylogenetic relationships between isolates, a number of 54 symptomatic fig leaves with chlorosis and mosaic symptoms were collected from different fig-growing areas in the center, north and south of Iran. Primary detection for all collected samples performed by DAS-ELISA using polyclonal AP-conjugated antibody which was raised against nucleocapsid protein of FMV positive samples in DAS-ELISA were checked by RT-PCR using NP gene specific primers. The amplified fragments of 14 isolates were cloned and sequenced. DAS-ELISA results indicated to a 55.5%FMV infection of collected isolates. Phylogenetic analysis on the basis of nucleotide sequences categorized the isolates in two main groups in which isolates from the center and northern regions of Iran placed in a separate subgroup beside other isolates from other countries which their complete coding sequences were available in GenBank of NCBI whereas the isolates from south of Fars province (Estahban and Jahrum districts) clustered in a separate phylogenetic group distinct from other Iranian and the world isolates which may show that genetic makeup of FMV may be affected by geographical isolation. A significant correlation between symptoms severity and phylogenetic groups observed that may put forward the probability of having a new viral strains in Fars province.
    Keywords: DAS, ELISA, Fig mosaic emaravirus (FMV), Nucleocapsid protein, Phylogenetic analysis, RT, PCR
  • حمیده رئیسی، محمدرضا صفرنژاد*، سید مهدی علوی، سید علی الهی نیا، ناصر فرخی
    بیماری شانکر باکتریایی مرکبات توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می شود. سیستم ترشحی نوع سه این باکتری دارای یک ساختار خارج سلولی رشته‏ای است که پروتئین های باکتریایی را به داخل سلول گیاه وارد می کند. پروتئین پیلین (HrpE) جزء اصلی تشکیل دهنده پیلوس می باشد که توسط ژن HrpE کد می‏شود. تولید پادتن اختصاصی علیه پروتئین پیلین می‏تواند به منظور شناسایی گیاهان آلوده و همچنین به عنوان منبع ژنتیکی مقاومت علیه بیماری مورد استفاده قرار گیرد. غیر‏فعال‏سازی پروتئین HrpE با استفاده از پادتن می‏‏تواند منجر به سرکوب بیماری در گیاه شود. هدف از این تحقیق جداسازی و بیان ژن HrpE و خالص‏سازی پروتئین حاصل از آن بود. برای این منظور، قطعه ژنی HrpE با استفاده از آغازگرهای اختصاصی جدا و در ناقل pTZ57R/T همسانه‏سازی شد. بیان این ژن به‏صورت نوترکیب در ناقل pET28a() و در سویه Rosetta باکتری Escherchia coli انجام شد. بهینه‏سازی تولید پروتئین نوترکیب تحت تاثیر زمان‏های مختلف، دمای نگهداری و همچنین غلظت‏های مختلف القا‏کننده مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 30 درجه سلسیوس و طی زمان 16 ساعت و با IPTG یک میلی‏مولار به‏دست آمد. خالص‏سازی پروتئین نوترکیب HrpE با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. نتایج آزمون‏های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از پادتن‏های اختصاصی، صحت بیان و خالص‏سازی پروتئین نوترکیب پیلین را مورد تایید قرار دادند. پروتئین نوترکیب تولید شده می‏تواند به عنوان آنتی‏ژن برای تولید پادتن‏های تخصصی تک همسانه‏ای و چند همسانه‏ای مورد استفاده قرار گیرد.
    کلید واژگان: شانکر باکتریایی مرکبات, پروتئین نوترکیب, سیستم ترشحی تیپ 3, ژن HrpE, پیلوس
    Hamideh Raisi, Mohammadreza Safarnezhad *, Mahdi Alavi, Ali Ellahinia, Naser Farrokhi
    Citrus bacterial canker is a disease caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The bacterial type III secretion system (TTSS) consist of an extracellular filamentous structure mediating transfer of bacterial proteins into the plant cytosols. The main part of the pilus is pilin protein (HrpE) that is encoded by the HrpE gene. Production of specific antibodies against the pilin protein can be implemented for detection of infected plants as well as to develop a source of genetic resistance against disease. Inhibition of HrpE protein through antibody therapy leads to suppression of disease in the plant. The objective of the present study was to isolate, clone and express the HrpE gene. To do this, the HrpE gene was amplified by PCR using gene-specific primers and cloned to the pTZ57R/T vector. Then, it was cloned to the pET28a() bacterial expression vector and expressed in the E. coli strain Rosetta as host. The protein production procedure was optimized for incubation time and temperature as well as the concentration of inducer. The greatest amount of the recombinant protein was yielded at 1 mM IPTG at 30° C for 16 h. Purification of HrpE recombinant protein was done via metal affinity chromatography. The results of both SDS-PAGE and Western blotting assays confirmed the expression accuracy and purity of recombinant pilin protein. The recombinant protein can be used as an antigen to develop monoclonal and polyclonal antibodies.
    Keywords: Citrus bacterial canker, Xanthomonas citri subsp. citri, recombinant protein, type III secretion system(TTSS), HrpE, pilus
  • حمیده رئیسی، محمدرضا صفرنژاد *، سید مهدی علوی، سید علی الهی نیا، ناصر فرخی
    شانکر باکتریایی مرکبات از بیماری های باغات لیمو در جنوب کشور با عامل Xanthomonas citri subsp. citriمی‏باشد. تکنیک فاژنمایی از راهکارهای تولید آنتی‏بادی های اختصاصی به منظور شناسایی گیاهان آلوده و همچنین تولید گیاهان مقاوم به بیماری است. در این تحقیق قابلیت استفاده از این سیستم برای تولید فاژهای نوترکیب حاوی قطعات آنتی‏بادی اختصاصی برعلیه باکتری عامل بیماری شانکر مرکبات بررسی شد. برای این منظور، پروتئین‏ تاثیرکننده (pthA) و پیلوس (HrpE) که از اجزای اساسی سیستم ترشحی نوع سه باکتری هستند و نقش ضروری در بیماری‏زایی پاتوژن دارند، به عنوان آنتی‏ژن انتخاب شدند. ابتدا پروتئین‏های pthA و HrpE به صورت نوترکیب در میزبان باکتریایی تولید شدند و با روش کروموتوگرافی خالص گردیدند. از کتابخانه های فاژی حاوی قطعات ژنی نواحی متغیر آنتی‏بادی برای جداسازی فاژهای اختصاصی استفاده شد. غنی‏سازی جمعیت فاژهای اختصاصی با انجام سه مرحله غربالگری بر علیه پروتئین های خالص شده pthA و HrpEانجام شد و اختصاصیت فاژهای حاصله بر علیه آنتی‏ژن توسط آزمون الیزا بررسی شد. فاژهای نوترکیب قابلیت اتصال به پروتئین های pthA و HrpE را داشته و قادر به ردیابی گیاهان آلوده به بیماری شانکر باکتریایی مرکبات نیز بودند. از فاژهای جداسازی شده می‏توان به منظور تولید آنتی‏بادی اختصاصی مونوکلونال استفاده نمود.
    کلید واژگان: افکتور پروتئین pthA, پروتئین HrpE, شانکر باکتریایی مرکبات, غربالگری, نمایش فاژی
    H. Raeisi, M. R. Safarnejad *, S. M. Alavi, S. A. Elahinia, N. Farrokhi
    Citrus bacterial canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc),is amongst the important diseases of lime orchards in southern parts of Iran. Phage display has been used to produce specific antibodies for detection of pathogen-infected plants as well as development of resistant varieties. An effector, namely pthA and a pilus protein, HrpE, the major critical components of type III secretion (T3S) system with roles in pathogenesis, were chosen as antigens. Recombinant forms of the proteins (pthA and HrpE) were expressed in a bacterial host and purified via affinity chromatography. Tomlinson phage display libraries including single chain variable fragments were used for isolation of the specific antibodies. Biopanning, 3 rounds against pthA and HrpE proteins, allowed enriching antigen-specific phages. The specificity of phages was tested using ELISA. Moreover, the phages were able to detect the plants infected with citrus bacterial canker.
    Keywords: Biopanning, citrus bacterial canker, effector protein pthA, HrpE protein, phage display
  • حسن رهنما، ناهید احمدی*، آرش آرش کیا، محمدرضا صفرنژاد
    بیان موقت، یکی از روش های موثر برای تایید کارایی پیشبرها در بیان ژن هدف در گیاهان است. در پژوهش حاضر، بیان آنتی ژن سطحی هپاتیت ب (HBsAg) در کنترل پیشبر دایمی CaMV35S و همچنین پیشبرهای اختصاصی بافت میوه گیاه گوجه فرنگی (E8 و 2A11) بررسی شد. بدین منظور از روش آگرواینفیلتریشن در بافت های برگی گیاه توتون و گوجه فرنگی و همچنین میوه گیاه گوجه فرنگی استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که دو پیشبر اختصاصی میوه، همانند پیشبر قدرتمند و دایمی CaMv35S، بیان زیاد آنتی ژن را در میوه های گیاه گوجه فرنگی باعث می شوند. اگرچه آنتی ژن HBsAg در بافت های برگی هم بیان شد، میزان آن نسبت به بافت میوه کمتر بود. شاید تولید اتیلن بر اثر زخمی شدن قطعات برگی، القای پیشبرهای اختصاصی میوه را باعث شده که خود بیان آنتی ژن مربوط را سبب شده است. نتایج پژوهش حاضر نشان می دهد که از پیشبرهای اختصاصی میوه گوجه فرنگی (E8 و 2A11) می توان به طور موثری برای بیان دایمی آنتی ژن HBsAg در گیاه گوجه فرنگی تراریخت استفاده کرد.
    کلید واژگان: بیان موقت, پیشبر اختصاصی, گوجه فرنگی, هپاتیت ب, _ HbsAg
    Hassan Rahnama, Nahid Ahmadi *, Arash Arashkia, Mohammad Reza Safarnejad
    Transient gene expression experiments are especially useful to confirm the efficiency of promoters used for expression of foreign molecule in plants. In this study, the expression of the hepatitis B surface antigene (HBsAg) under the control of the CaMV35S and fruit tissue-specific (E8 and 2A11) promoters were studied in the leaf tissues of tobacco and tomato plants and tomato fruits using agroinfilteration technique. The results showed that fruit-specific promoters as the constutative CaMv35S promoter cause over-expression of the antigen in tomato plant fruits. However, HBsAg antigen was expressed in the leaf tissues, but its rate was lower than the fruits. Ethylene produced by the wounded leaf parts may induce fruit-specific promoter, which in turn is related antigen expression. The results show that the tomato fruit specific promoters (E8 and 2A11) can be used as for efficient expression of HBsAg antigen in transgenic tomato plants.
    Keywords: HBsAg, Hepatitis B, Specific promoters, Tomato, Transient Expression
  • محمدرضا صفرنژاد، محمد علیمردانی، عبدالقادر سعدی زاده، مولود خلیلیان، محمدحسین دانشور، محمد علی ابراهیمی، غلامرضا صالحی جوزانی
    ریز جلبک Dunaliella salina از جمله جلبک های سبز تک سلولی متحرک می باشد که دارای توانایی بسیار بالایی برای رشد در شرایط شور بوده و به دلیل دارا بودن مزایای مختلف به عنوان یک کارخانه سلولی سبز جهت تولید فرآورده های ارزشمند دارویی از قبیل واکسن ها، هورمون ها، فاکتورهای رشد، آنتی بادی های مونوکلونال و سایر پروتئین های نوترکیب مورد توجه می باشد. در این تحقیق روش های انتقال ژن خارجی به این ریزجلبک مورد بررسی قرار گرفته است. در اولین قدم و به منظور استفاده از نشانگرهای انتخابی در فرآیند انتقال ژن، آزمون تعیین میزان حساسیت به ترکیبات بازدارنده رشد از قبیل کانامایسین، هیگرومایسین، کلرامفنیکل و فسفینوتریسین انجام شد. نتایج این آزمون حاکی از حساسیت ریز جلبک به فسفینوتریسین در غلظت 7 میکروگرم در میلی لیتر بود. برای انتقال ژن از روش های همزدن با ذرات شیشه، الکتروپوراسیون، اگروباکتریوم و بمباران با تفنگ ژنی استفاده شد. سازه های مورد استفاده در این تحقیق حاوی ژن های گزارشگر gus، ژن انتخابگر bar و همچنین ژن کدکننده آنتی ژن سطحی ویروس هپاتیت بی تحت کنترل پیشبر های 35S و یوبی کوئیتین بود. نتایج حاصله حاکی از موفقیت آمیز بودن روش استفاده از ذرات شیشه و همچنین تفنگ ژنی در فرآیند انتقال ژن بود. در این روش ها سلول های جلبک تراریخته قابلیت رشد خود را در محیط کشت حاوی نشانگر انتخابی فسفینوتریسین حفظ کرده و حضور و بیان ژن های خارجی و نشانگر انتخابی با روش های PCR و RT-PCR تایید شد. همچنین بیان ژن gus در سلول های تراریخته، با استفاده از رنگ آمیزی هیستوشیمیایی مورد تایید قرار گرفت.
    کلید واژگان: انتقال ژن ریز جلبک ژن گزارشگر gus واکسن هپاتیت ب Dunaliella salina
    Safarnejad Mr, Alimardani M., Sadizadeh A., Khalilian M., Daneshvar Mh, Ebrahimi Ma, Salehi Jouzani Gh*
    Microalgae Dunaliella salina is a single-cell eukaryotic organism which is able to grow in high salt concentration. It has several advantages as a green bioreactor for producing of several pharmaceutical drugs including vaccines, hormones, growth factors, monoclonal antibodies and other recombinant proteins. In present study some gene transformation methods were applied for insertion of foreign genes into the microalgae cells. In the first step and to determine suitable selectable marker, some growth inhibitory compounds, such as kanamycin, hygromaicin, chloramphenicol and phosphinotricine were used. The results indicate the sensitivity of microalgae D. salina to phosphinotricine in concentration of 7 µg/ml. Then, the gene bar, encoding phosphinotricine transferase, was introduced as selectable marker in transformation process. The methods applied in gene transformation include agitation with glass beads, electroporation and gene gun bombardment. The constructs containing the GUS gene applied for optimizing of the transformation process. To evaluate the effect of different promoters, the cauliflower mosaic virus 35S and maize ubiquitine promoters were used for expression of the GUS reporter gen. The expression of GUS reporter gene was evaluated by histochemical staining method. The results obtained here proved efficiency of the glass beads method for successful expression of foreign gene. In stable nuclear transformation methods, the transformed D. salina cells were cultured on media containing phosphinotricine selectable marker. These results proved capability of 35S promoter in transformation using glass beads method. The construct harbouring HBsAg gene was applied for gene transformation into microalga by using biolistic, glass beads agitation and agrobacterium co-cultivation. The transformed cells were moved into selective media. The presence of foreign gene in the transformed cells was analyzed by molecular approaches including PCR and RT-PCR. These results prove capability of biolistic and glass bead approaches for successful gene transformation into D. salina.
    Keywords: Dunaliella salina_Gene transformation_Gus reporter gene_Hepatitis B virus_Microalgae
  • مریم مختاری، محمدرضا صفرنژاد، سید مهدی علوی، آدم ترکمن زهی
    بیماری شانکر باکتریایی مرکبات از جمله مهمترین بیماری های باغات لیموی مکزیکی در جنوب کشور می باشد که توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می شود. پروتئین PthA باکتری عامل شانکر مرکبات، به عنوان پروتئین افکتور، نقش اساسی در فرایند بیماری زایی دارد و لذا غیر فعال سازی آن با استفاده از آنتی بادی می تواند منجر به ایجاد مقاومت بر علیه بیماری شود. در این تحقیق جداسازی و بیان ژن pthA و خالص سازی پروتئین حاصل از آن صورت پذیرفته است. برای این منظور با استفاده از منابع اطلاعاتی بانک ژن، آغازگرهای اختصاصی برای جداسازی ژن pthA طراحی شد و سپس قطعه ژنی مربوطه در ناقلpTZ57R/T همسانه سازی گردید. ژن مزبور سپس به صورت متصل به دنباله شش تایی هیستیدین در ناقل بیانی باکتریایی pET28a همسانه سازی گردیده و بیان آن به صورت نوترکیب در سویه BL21(DE3) باکتری Escherichia coli صورت پذیرفت. خالص سازی پروتئین نوترکیب PthA در شرایط طبیعی غیر واسرشتی و با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. صحت بیان پروتئین مذکور با روش های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی توالی شش تایی هیستیدین مورد بررسی و تایید قرار گرفت. پروتئین نوترکیب خالص بدست آمده می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید آنتی بادی های نوترکیب مونوکلونال مورد استفاده قرار گیرد.
    Mokhtari M., Safarnejad M.R., Alavi S.M., Torkamanzehi A
    The citrus bacterial canker is among the most important diseases in Mexican lime gardens in southern area of Iran. The disease is caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The PthA bacterial protein, as an effector protein, is crucial in pathogenesis pathway. Inhibition of its functions through antibody could lead to suppression of disease in plant. The present study was performed for isolation and expression of pthA gene and purification of PthA recombinant protein. For this aim the specific primers were designed for isolation of 606 bp of hydroxyl terminal of this gene followed by PCR amplification and cloning into pTZ57R/T vector. The coding sequence of truncated pthA was inserted to pET28a bacterial expression vector as a C-terminal fusion to 6XHis tag. Production of recombinant protein was performed in BL21(DE3) strain of E. coli. The purification was done under native condition through affinity chromatography on nickel column. Total yield was assessed by SDS-PAGE and western blotting analysis. The results confirmed production of PthA recombinant protein with molecular weight around 26 kDa. The purified recombinant protein could be used as an antigen for production of recombinant monoclonal antibodies.
    Keywords: Citrus bacterial canker, Xanthomonas citri subsp citri, recombinant protein, PthA, effector protein
  • محمد علی سبک خیز خیاط، بهروز جعفرپور، فرج الله شهریاری احمدی، سعید طریقی، محمدرضا صفرنژاد

    ویروس موزائیک شلغم (Turnip mosaic virus; TuMV) یکی از اعضاء مهم جنس Potyvirus در خانواده Potyviridae و یکی از مهم ترین ویروس های آلوده کننده گیاهان خانواده چلیپائیان (Brassicaceae) می باشد. در فروردین 1391 علایم یک بیماری مشکوک ویروسی مانند موزائیک، کوتولگی و بدشکلی بوته در علف هرز خردل کاذب مشاهده گردید و وجود ویروس موزائیک شلغم با آزمون RT-PCR و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن پروتئین پوششی (coat protein; CP) این ویروس مورد بررسی قرار گرفت. قطعه تکثیر شده (986 جفت باز) ابتدا خالص سازی و سپس تعیین ترادف گردید. آنالیز توالی نوکلئوتیدی وآمینواسیدی پروتئین پوششی، به ترتیب شباهت بین 42/85 تا 58/89 و 64/91 تا 12/95 را با 31 جدایه دیگر این ویروس در دنیا نشان داد. درخت فیلوژنتیکی با نرم افزار MEGA6 و روش Neighbour joining ترسیم شد. نتایج این بررسی فیلوژنتیکی نشان داد که این جدایه ویروس موزائیک شلغم با سه جدایه دیگر از ایران در گروه Basal-B قرار دارند.

    کلید واژگان: تحلیل فیلوژنتیکی, خردل کاذب, شناسایی مولکولی, ویروس موزائیک شلغم (TuMV)
    M. A. Sabokkhiz, B. Jafarpour, F. Shahriari Ahmadi, S. Tarighi, M.R. Safarnejad

    Turnip mosaic virus (TuMV) is amember of the Potyvirus genus within the Potyviridae family and is one the most important viruses infecting Brassicaceae plants. In April 2012, suspicious symptoms of a viral disease such as mosaic, stunting and malformation were observed on Herschfeldia incana. The collected samples were tested using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) with specific primers corresponding to TuMV coat protein gene. Amplified fragment (986bp) was first purified and then directly sequenced. Analysis of its CP nucleotide and amino acid sequence revealed 85.42-89.58 % and 91.64-95.12% similarity to those of 31 TuMV isolates from other countries respectively. Phylogenetic tree was constructed by MEGA6 software using neighbor joining method. The results showed that the TuMV isolate and 3 Iranian isolates have been clustered into the basal-B group.

    Keywords: Hirschfeldia incana (L.) Lagr., Foss., Molecular identification, Phylogenetic analysis, Turnip mosaic virus (TuMV)
  • مهدی شیرازی، محمدرضا صفرنژاد، فرشاد رخشنده رو، حمیدرضا زمانی زاده
    ویروس آبله آلو (Plum pox virus، PPV) یکی از خسارتزاترین ویروس های درختان میوه هسته دار در دنیا می باشد. به منظور ردیابی و بررسی خصوصیات مولکولی جدایه های ایرانی PPV، طی سال های زراعی 93-91، تعداد 130 نمونه برگی درختان هسته دار با علایم ویروسی از باغات درختان هسته دار استان های اردبیل، مازندران و تهران جمع آوری شدند. ردیابی ویروس با روش های ELISA DAS-، ایمونوبلات و همچنین RT-PCR با آغازگر های اختصاصی ژن پروتئین پوششی (CP) ویروس صورت پذیرفت. نتایج بدست آمده حاکی از وجود آلودگی در برخی از نمونه ها شامل 3 نمونه از دشت مغان، 24 نمونه از جویبار و 2 نمونه از درکه بود. محصول RT-PCR بدست آمده از تکثیر ناحیه ژن CP ویروس به طول 990 جفت باز مربوط به سه جدایه تعیین توالی گردیده و ترادف ناحیه کد کننده با سایر جدایه های موجود در NCBI مقایسه شدند. نتایج این آزمون نشان داد که دو جدایه 10s و 15s (از منطقه جویبار) دارای 3 /99 و 4 /99 درصد تشابه با سویه M (رس شمار EF626533.1) و جدایه M6 (از دشت مغان) دارای 4/ 99 درصد شباهت با سویه D ویروس (رس شمار HF585098.1) می باشند. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی سویه های M و D ویروس آبله آلو بر مبنای توالی نوکلئوتیدی در مناطق ذکر شده می باشد.
    کلید واژگان: تعیین توالی, سویه های M و D, ویروس آبله آلو, RT, PCR, DAS, ELISA
    M. Shirazi, M. R. Safarnejad, F. Rakhshandehroo, H. R. Zamanizadeh
    Plum pox virus (PPV) is considered as one of the most devastating viruses of stone fruits in the world. During the growing seasons of the years 2012-2014, to detect and determine molecular characterization of Iranian isolates of PPV, sampling was done from stone fruit gardens in some parts in north and north western and central of Iran. A total number of 130 symptomatic Prunus leaf samples with virus like symptoms and symptomless weeds were collected from Ardebil, Mazandaran and Tehran. PPV detection was performed using DAS-ELISA, Dot Immuno Binding Assay and also RT-PCR with specific designed primers amplifying the gene encoding coat protein (CP). The results obtained from serological and molecular assays revealed presence of infection in 3 samples from Dasht-e Moghan, 24 samples from Jouybar and 2 samples from Darakeh. PCR amplicons belongs to the different regions were sequenced and compared with the corresponding worldwide strains available in NCBI. Comparisons showed the close similarity between the M6 isolate (from Dasht-e Moghan) and 15S and 10s isolates (from Jouybar) with the D (acc. nr. HF585098.1) (99.4%) and M (acc nr EF626533.1) (99.3% and 99.4%) strains of PPV, respectively. To the best of our knowledge, this is the first report of molecular detection of M and D strains of PPV in the studied regions based on the nucleotide sequence.
    Keywords: DAS, ELISA, M, D strains, Plum pox virus, RT, PCR, Sequencing
نمایش عناوین بیشتر...
بدانید!
  • در این صفحه نام مورد نظر در اسامی نویسندگان مقالات جستجو می‌شود. ممکن است نتایج شامل مطالب نویسندگان هم نام و حتی در رشته‌های مختلف باشد.
  • همه مقالات ترجمه فارسی یا انگلیسی ندارند پس ممکن است مقالاتی باشند که نام نویسنده مورد نظر شما به صورت معادل فارسی یا انگلیسی آن درج شده باشد. در صفحه جستجوی پیشرفته می‌توانید همزمان نام فارسی و انگلیسی نویسنده را درج نمایید.
  • در صورتی که می‌خواهید جستجو را با شرایط متفاوت تکرار کنید به صفحه جستجوی پیشرفته مطالب نشریات مراجعه کنید.
درخواست پشتیبانی - گزارش اشکال