طراحی کنترل داخلی واکنش زنجیره ای پلیمراز باکتری مایکوپلاسما به روش رقابتی

مایکوپلاسماها مهمترین و جدی ترین آلوده کننده های فرآورده های بیولوژیک تولیدی در کشت های سلولی می باشند. تکنیک PCR جهت شناسایی سریع جنس مایکوپلاسما، از اولویت بالایی برخوردار است. اما یکی از معایب این روش، نداشتن کنترل داخلی است. هدف اصلی این مطالعه، استاندارد کردن تست PCR تشخیص جنس مایکوپلاسما از طریق ساخت کنترل داخلی به روش رقابتی است.
با استفاده از پرایمرهای ویژه ی هدف 16S rRNA، تست PCR جهت تشخیص مولکولی جنس مایکوپلاسما بهینه شد. پرایمرهای مرکب (Composite Primer) برای کنترل داخلی با استفاده از پرایمرهای ژن کینتوپلاست انگل لیشمانیا طراحی و سپس قطعه ی کنترل داخلی تکثیر گردید. هر دو محصول هدف و کنترل داخلی بعد از خالص سازی به پلاسمید PTZ57 R اتصال و سپس در باکتری اشرشیا کلی JM107 ترانسفورم و نهایتا کلون گردید.
اندازه ی محصول تشخیصی و کنترل داخلی به ترتیب 272bp و 672bp بود، که از نظر اندازه، اختلاف مطلوبی با هم داشتند. تعداد حداقل کنترل داخلی در هر واکنش، 1000 عدد تعیین شد. حساسیت تست PCR برای تشخیص جنس مایکوپلاسما، 10 باکتری به دست آمد. در تست ویژگی با عوامل مختلف، هیچ محصول ناخواسته ای مشاهده نشد. طیفی که در آن تکثیر کنترل داخلی مشاهده شد، بین صد تا ده میلیون باکتری بدست آمد.
در کنار سرعت و دقت بالای تکنیک PCR، نتایج منفی و مثبت کاذب که به دلیل وجود مهارکننده های واکنش PCR رخ می دهند، می تواند کارایی این روش را کاهش دهد. استفاده از یک DNA دیگر به عنوان کنترل داخلی می تواند این خطاها را شناسایی کند.