همسانه سازی، بهینه سازی شرایط بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب Nef-MPER-V3 ویروس HIV-1 در سیستم بیانی پروکاریوتی

پروتئین تنظیمی Nef و همچنین  پروتئین های ساختاری MPER و V3 ویروسHIV از اهداف مهم در مطالعات واکسن بشمار می روند. لذا در مطالعه حاضر، پروتئین فیوژن Nef-MPER-V3 در سیستم بیانی پروکاریوتی کلون، بیان شد تا به عنوان کاندید مناسب در مطالعات آتی واکسن مورد ارزیابی قرار گیرد.

توالی ژن Nef-MPER-V3  سنتز و توسط آنزیم های NotI /HindIII به داخل وکتور pET-28a کلون شد. سپس، بیان پروتئین نوترکیب در سیستم بیانی BL21(DE3) انجام شد. به منظور بهینه سازی بیان، فاکتورهایی نظیر زمان القاء، غلظت IPTG و دانسیته نوری (OD) مورد ارزیابی قرار گرفت. پروتئ میزان بیان توسط الکتروفورز SDS-PAGE تعیین گردید. سپس، پروتئین با استفاده از ستون  Ni-NTA agarose تخلیص شد و نهایتا، توسط وسترن بلات تعیین هویت  و تایید شد.

ژن هدف با موفقیت در وکتور بیانی کلون و پس از انتخاب بهترین شرایط بیان شامل: غلظت 2 میلی مولار IPTG درکدورت نوری7/0OD600nm= و  بمدت پنج ساعت پس از القاء، پروتئین بیان شده بوسیله کروماتوگرافی تمایلی تحت شرایط دناتوره و با استفاده از اوره  با غلظت حدود 300 میکروگرم در میلی لیتر تخلیص شد. پروتئین فیوژن تخلیص شده بصورت یک باند واضح حدود 35 کیلودالتون در SDS-PAGE مشاهده شد و با استفاده از آنتی بادی ضد Nef در وسترن بلات آشکار شد.
 

نتایج ما نشان داد که پروتئین نوترکیب NEF-MPER-V3 در سیستم بیانی BL21 (DE3)  بخوبی بیان شده و پروتئین تخلیص شده قابلیت استفاده در آزمایشات آتی به منظور ارزیابی ایمنوژنسیتی آن در موش که در حال انجام می باشد را دارد.