بیان پروتئین انسولین گیاهی در مخمر پروبیوتیک Saccharomyces boulardii

دیابت نوعی اختلال مزمن در متابولیسم کربوهیدرات، چربی و پروتئین هاست و مشخصه آن افزایش قند خون در بیمار است. نارسایی قلبی - عروقی، کلیوی و کاهش فعالیت عصبی از جمله عوارض طولانی مدت این بیماری می باشد. کاربرد داروهای گیاهی برای درمان دیابت، روز به روز بیشتر میشود و این مسئله سبب شده شناخت داروی گیاهی کارآمد اهمیت بیشتری یپیدا کند. داروهای گیاهی به دلیل عوارض کمتر، قیمت مناسب و دردسترس بودن نسبت به داروهای شیمیایی مورد توجه قرارگرفته است. یکی از گیاهان موثر، خربزه تلخ یا کارلا با نام علمی Momordica charantia یک گیاه دارویی متعلق به خانواده کدوییان (Cucurbitacea) است که به دلیل دارا بودن ترکیباتی از جمله پلی پپتیدی به نام پلی پپتید P یا P- انسولین در درمان دیابت موثر می باشد. P- انسولین متشکل از 172 اسید آمینه است و مقدارش در گیاه بسیار کم است. کلون کردن ژن p- انسولین و بیان بالای آن در میکروارگانیسم، راه حلی سریع و مفید برای حل این مشکل است. استفاده از مخمر پروبیوتیک این مزیت را دارد که پس از تولید پروتئین هدف نیاز به خالص سازی آن نیست در صورتیکه تولید پروتئین نوترکیب در سایر میزبان های بیانی مستلزم خالص سازی آن جهت مصرف می باشد. بدین منظور در این تحقیق توالی ژن p- انسولین پس از بهینه سازی از لحاظ توالی در میزبان مخمر پروبیوتیکی Saccharomyces boulardii بیان شد. در این تحقیق بهینه سازی توالی ژن p- انسولین جهت بیان در مخمر پروبیوتیک S. boulardii به دو طریق بهینه سازی کدونی و بهینه سازی ساختار ثانویه mRNA انجام گردید. توالی ژن بهینه سازی شده در وکتور بیانی pESC تحت پروموتر القایی Gal10 کلون و به سلول مستعد S. boulardii ترانسفورم شد. از مخمر نوترکیب استخراج DNA و در ادامه با آغازگرهای اختصاصی ژن p- انسولین واکنش PCR انجام گرفت. مخمر نوترکیب توسط گالاکتوز القاء و تولید پروتئین P- انسولین در سیتوپلاسم مخمر نوترکیب از طریق SDS-PAGE و طیف سنجی جرمی تایید گردید. واکنش زنجیره ای پلی مراز با آغازگرهای اختصاصی ژن p- انسولین قطعه 350 جفت بازی را از وکتور بیانی نوترکیب تکثیر کرد که نشان از کلونینگ موفق ژن مذکور بود. الگوی الکتروفورز SDS-PAGE برای S. boulardii میزبان و S. boulardii ترانسفورم شده با ناقل pESC/p-insulin مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج الکتروفورز پروتئین نشان داد که باند پروتئین P- انسولین با وزن مولکولی 18.5 KD و بصورت افتراقی فقط در مخمر نوترکیب بیان گردید. همچنین نتایج طیف سنجی جرمی تایید کرد که باند افتراقی مربوط به پروتئین P- انسولین می باشد. در این تحقیق برای اولین بار از مخمر پروبیوتیک S. boulardii به عنوان میزبان موفق برای تولید پروتئین p- انسولین استفاده گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که از مخمر پروبیوتیک S. boulardii می توان به عنوان میزبان مناسب برای تولید سایر محصولات در صنایع غذایی و دارویی استفاده کرد.