طراحی گام به گام وکتورهای محبوب و شایع در دست ورزی ژنتیکی با استفاده از سیستم CRISPR/Cas9

زمینه و هدف:

 ویرایش ژنوم روشی کارآمد و دقیق در مطالعات بیولوژیکی و پزشکی است. در میان طیف وسیعی از تکنیک های ویرایش ژنوم، تکرارهای کوتاه پالیندرومی بافاصله منظم خوشه ای (CRISPR) یکی از ساده ترین روش ها و درعین حال بسیار امیدوارکننده است. سیستم CRISPR از دو جزء کلیدی تشکیل شده است. یک آنزیم اندونوکلیاز به نام Cas9 و یک هدایت کننده RNA (gRNA) که اطمینان حاصل می کند که آنزیم Cas9 نقطه مناسبی از ژنوم را برش می دهد. اگرچه ویرایش ژنوم بر پایه CRISPR یکی از روش های مفید برای اصلاح ژنوم است؛ اما هنوز چالش های متعددی در مراحل این تکنیک وجود دارد.

RNA های راهنما بر اساس مکان هدف و وکتور موردنظر طراحی و سفارش داده شدند. مراحل کلونینگ انجام شد و با تعیین توالی، به عنوان یک روش استاندارد طلایی تایید شدند. فهرستی از RNA های راهنما کارآمد برای ژن LAMP-2 بر اساس پایگاه های داده برجسته موجود و با تجزیه وتحلیل و مقایسه اختصاصیت و عملکرد به عنوان دو ویژگی اصلی فراهم شد.  

در این مطالعه سعی شده است تا چالش های اصلی در فرایند تهیه وکتورهای محبوب (pX330/pX459) سیستم CRISPR/Cas9 بررسی شوند. همچنین فهرستی از RNA های راهنما کارآمد برای یک ژن اتوفاژی نیز به عنوان مثال برای روشن شدن روش های طراحی RNA راهنما فراهم آمده است.

در این مقاله سعی شده است تا مشکلاتی که احتمال می رود در طول طراحی RNA راهنما و آماده سازی پلاسمید به وجود آید، به تصویر کشیده شوند و به دنبال آن توصیه های مناسب برای حل آن ها ارایه شود.