بررسی بیان ژن های دخیل در ایمنی ذاتی در سلول های ماکروفاژ انسانی در مواجهه با باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس

یکی از اهداف سلولی اولیه مایکوباکتریوم ها، ماکروفاژها هستند که باکتری استراتژی های مختلفی برای زنده ماندن و تکثیر در داخل فاگوزوم ها از جمله مانند ممانعت از اسیدیفیکاسیون فاگوزوم و ممانعت از ادغام فاگوزومی دارند. از طرفی اهمیت polarization و plasticity ماکروفاژها در مواجهه با عوامل عفونی، بین ماکروفاژهای M1 و M2 کاملا شناخته شده است. باتوجه به نقش دو ژن DUSP14 و RAP2A در فرایندهای ایمنی ذاتی، هدف از این مطالعه بررسی بیان این ژن ها در ماکروفاژهای افراد سالم آلوده شده با سویه های PB8، H37Rv و MTBRils است تا بتوان درک جامع تری از چگونگی عملکرد ایمنی ذاتی به دست آید.

در این مطالعه تجربی، پنج فرد سالم که نتیجه تست PPD آن ها منفی بوده است و سابقه ابتلا به بیماری سل را نداشتند انتخاب شدند. سپس PBMC ها با استفاده از گرادیانت فایکول جدا شده و با دستگاه Cell Counter تعداد سلول های موجود در رسوب شمارش گردید در ساخت محیط کشت به ازای 500 میلی لیتر محیط stem span، 2 میلی لیتر لیپید کلسترول و 5 میلی لیتر (10x) Pen/Strep به محیط اضافه شد و پس از 9 روز در محیط کشت غنی شده، تمایز و در نهایت بیان ژن های DUSP14 و RAP2A پس از مواجهه با سه سویه PB8، H37Rv و MTBRils طی 4، 18 و 48 ساعت پس از آلوده کردن سلول ها در محیط کشت، با روش ریل تایم بررسی گردید. بدین صورت که در ابتدا mRNA از محیط استخراج شد و از روی آن cDNA ساخته شد و PCR با مسترمیکس Takara صورت پذیرفت. جهت اندازه گیری میزان نسبی بیان تک تک ژن ها از روش -ΔΔ Ct2 استفاده شد. به همین منظور میزان بیان هر ژن در مقایسه با ژن رفرنس برای هر بیمار در سه مرحله بررسی شد. جهت بررسی آماری از نرم افزار SPSS نسخه 22 و GraphPad Prism نسخه 8 استفاده شد.

نتایج نشان داد که 4 ساعت پس از تیمار سلول ها با سویه H37Rv بیان ژن RAP2A نسبت به دو سویه دیگر بیان بیش تری داشته است، اگر چه افزایش بیان معنی دار نیست. هم چنین بیان ژن DUSP14 در 4 ساعت پس از آلوده شدن با همه سویه ها اگرچه افزایش معنی داری پیدا نکرد؛ اما در سویه PB8 افزایش بیان بیش تری نسبت به سویه های دیگر داشت. در این مطالعه نشان داده شد که بیان ژن RAP2A پس از گذشت 48 ساعت از آلودگی ماکروفاژها، سویه های H37Rv و MTBRils نسبت به PB8 و گروه کنترل کاهش نشان داد. بیان ژن DUSP14 نیز در همه زمان ها در گروه H37Rv و MTBRils نسبت به PB8 و گروه کنترل کاهش معنی داری دیده شد.

کاهش بیان ژن RAP2A در دو سویه مایکوباکتریوم H37Rv و MTBRils نشان می دهد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با کاهش فعالیت GTPase، سعی در اختلال در روند فاگوزوم و شیفت پاسخ ها به سمت ماکروفاژهای M2 دارد. مطالعات آتی بر روی نقش پلی مورفیسم های ژن های RAP2A و DUSP14 توصیه می گردد.