ساخت و کلونینگ cDNA فاکتور کلنی گرانولوسیت انسانی (hG-CSF)

فاکتور محرکه کلنی گرانولوسیت انسانی یکی از فاکتورهای رشد خونساز است که تکثیر و تمایز سلول های پیش ساز گرانولوسیت نوتروفیلی و تشکیل کلنی نوتروفیلی سلول های مغز استخوان را تحریک می کند. این فاکتور همچنین تمایز نهایی بعضی از سلول های لوسمی میلوییدی را القا می کند. hG-CSF در منوسیت ها و ماکروفاژهای انسانی در پاسخ به آندوتوکسین باکتریایی و همچنین در رده های سلولی انسانی نظیر کارسینومای حفره دهانی 2-CHU و کارسینومای مثانه 5637 تولید می شود. هدف این پژوهش، استخراج RNA کل از سلول های تحریک شده منوسیت انسانی، سنتز cDNA دو رشته ای hG-CSF و در نهایت کلون کردن cDNA سنتز شده در یک ناقل کلونینگ مناسب بود.
در ابتدا، سلول های منوسیت از خون محیطی فرد طبیعی جداسازی شد. این سلول ها کشت داده شد و به طور همزمان به وسیله محرک های لیپوپلی ساکارید باکتریایی (LPS) و اینترفرون گامای انسانی (hIFN-) تحریک شد. RNA کل، از سلول های استخراج شد و به دنبال آن هر دو cDNA دارای ترادف راهنما (کدکننده پروتئین اولیه) و فاقد ترادف راهنما (کدکننده پروتئین بالغ) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و بر اساس روش RT-PCR سنتز شد. همچنین هر دو cDNA مذکور به طور همزمان از RNA کل استخراج شده از سلول های کارسینومای مثانه انسانی 5637 سنتز شد. در مرحله بعد هر دو cDNA با استفاده از آنزیم محدودگر StyI که بر روی ژل الکتروفورز تشکیل سه قطعه مجزا می دهد، مرد تایید قرار گرفت. سپس cDNA دارای ترادف راهنمای مشتق از منوسیت ها درون ناقل کلونینگ pBluescriptIISK داخل و در باکتری اشریشیاکلی (سویه F10TOP) کلون شد.
نتایج و بحث: به دنبال غربالگری، کلنی های صحیح انتخاب شد و ناقل نوترکیب از باکتری های تراریخته، استخراج و با استفاده از آنزیم های محدودگر NcoI، StyI، EcoRI، BamHI تایید شد. برای تایید نهایی، ناقل نوترکیب صحیح انتخاب و قعطه کلون شده، تعیین توالی شد. بعداز تایید ترادف نوکلئوتیدی قطعه کلون شده؛ با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ناقل نوترکیب به عنوان الگو و با کمک PCR، cDNA فاقد ترادف راهنما سنتز و در ناقل کلونینگ داخل و در باکتری TOPIOF کلون شد. در نهایت کلون صحیح انتخاب شد و با استفاده از آنزیم های محدودگر مورد تایید قرار گرفت.