کلونینگ و بیان ترشحی ژن لیپاز (BTL2) باسیلوس ترموکاتنولاتوس در پیکیا پاستوریس با استفاده از توالی های نشانه طبیعی و آلفا فاکتور مخمری

لیپاز (Triacylglycerol acylhydrolase EC 3.1.1.3)، هیدرولیز تری آسیل گلیسرول به گلیسرول و اسیدهای چرب را در حد فاصل لایه چربی و آب کاتالیز می کند. لیپازها در فرمولاسیون شوینده ها، تهیه بیوسورفکتانتها، صنایع روغن، غذایی، کشاورزی، چوب و کاغذ، پزشکی و دارویی کاربرد دارند. مهم ترین کاربرد این آنزیم در صنایع شوینده است. در این تحقیق، پس از استخراج DNA ژنومی باکتری باسیلوس ترموکاتنولاتوس) Bacillus thermocatenulatus (مولد لیپاز، ژن لیپاز btl2 (همراه با توالی نشانه و بدون توالی نشانه) با روش PCR تکثیر و در حامل بیانی pPIC9 تحت کنترل پروموتر الکل اکسیداز کلون شد pYV128) و (pYV129 پس از تایید صحت کلونینگ توسط PCR و برش آنزیمی، پلاسمیدهای نوترکیب فوق با آنزیم Bgl II خطی شده و با روش الکتروپوریشن به میزبان پیکیا پاستوریس (Pichia pastories) انتقال داده شدند. مخمر پیکیا پاستوریس نوترکیب در محیط BMGY کشت داده شد و با متانول بیان آنزیم لیپاز القاء شد. وجود آنزیم در محیط کشت با آزمون پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) و روش ایمونوبلات تایید شد. خالص سازی لیپاز نوترکیب به روش تعویض یونی انجام و فعالیت ویژه آنزیم به روش pH- stat تعیین شد. نتایج تولید U/L 18000 لیپاز نوترکیب در کشت فلاسک و کسب U/L12000 آنزیم نوترکیب خالص (راندمان خالص سازی 66 درصد) با فعالیت ویژه /mgμ 5728 را نشان داد.