بهینه سازی استخراج DNA برای مطالعه طول تلومر از نمونه های خون منجمد

بهینه سازی استخراج DNA در راستای حفظ طول تلومر به عنوان زیست نشانگر پیری و انواع بیماری ها بسیار مهم است. نمونه های خونی که به طور طولانی مدت نگهداری شده اند، منبع بسیار مهمی برای مطالعات ژنتیکی محسوب می شوند. در این مطالعه با استفاده از بافرهای لیز مختلف به همراه بافر استخراج CTAB، کیفیت DNA استخراجی و اثر بازدارنده های همراه آن بر روی PCR کمی در مطالعات تلومر بررسی شد.

استخراج DNA با 6 بافر لیزکننده گلبول قرمز و بافر استخراج بر پایه CTAB، انجام شد. یکپارچگی DNA با ژل الکتروفورز، کمیت با جذب در 260 نانومتر و خلوص آن با مقادیر مورد انتظار 8/1 و 2/2-2 برای نسبت های 280A/260A و 230A/260A ارزیابی گردید. ارزیابی کمی اثر هر بافر در واکنش q-PCR و تکرارپذیری نتایج به ترتیب با محاسبه بازده واکنش، ضریب تعیین (R2) و درصد ضریب تغییرات (%CV) محاسبه شد.

بیش ترین مقدار DNA استخراج شده (324/93 نانوگرم بر میلی لیتر، 11/53CV%:) با استفاده از بافر 5 (10 میلی مولار Tris-HCL 6/7pH=، 50 میلی مولار NaCl) به دست آمد. تمامی بافرها مقادیر مطلوب برای 280A/260A و 230A/260A داشتند و از نظر خلوص DNA تفاوتی (0/05>p) نداشتند. طبق نتایج ژل، DNA استخراج شده همه بافرها به جز یکی، فاقد خردشدگی بود. مولکول DNA استخراج شده با بافر 1 (NH4Cl 155میلی مولار، KHCO3 10 میلی مولار و EDTA 5 میلی مولار) بهترین عملکرد را در واکنش q-PCR برای ژن HBG (0/126=E و 0/97=R2) و تلومر (0/99= بازده، 0/99=R2) داشت.

مولکول DNA استخراج شده با بافر 1 از نمونه خون منجمد جهت مطالعه تلومر کم ترین بازدارندگی q-PCR را نشان داد.